神農架國家公園林線過渡帶土壤真菌多樣性

盛玉鈺,叢 靜,盧 慧,3,楊開華,楊林森,王 敏,張于光,*

1 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所,國家林業局森林生態環境重點實驗室,北京 100091 2 青島大學附屬醫院,青島 266061 3 中央民族大學,生命與環境科學學院,北京 100081 4 神農架國家公園管理局,神農架金絲猴保育生物學湖北省重點實驗室,神農架林區 442411

林線過渡帶是高山郁閉森林到矮曲林之間的生態過渡帶[1],是高山垂直植被帶的重要生態過渡區,是陸地生態系統對氣候變化響應的敏感區域[2- 4]。研究表明,氣候變化使林線過渡帶位置出現向上、不變或向下等不同的響應趨勢,表明林線動態變化的影響機制復雜多變[5]。目前,有關林線區植被格局和氣候變化響應[6- 8]、凋落物分解[3]、土壤碳氮循環[9]、幼苗建植[10]等方面已有較多研究報導,但關于林線土壤微生物的研究相對較少,且多限于微生物的降解活性[11]、土壤細菌多樣性[12],忽略了其土壤真菌群落結構組成和形成機制,造成林線土壤微生物的理論體系有大部分的缺失。本研究將將致力于完善整個林線土壤微生物生態系統理論。

真菌是土壤微生物的主要組成部分,不僅可以有效降解土壤中復雜組分和凋落物,還可以監測土壤病理過程、驅動養分循環和能量流動,是陸地生態系統的重要健康指標[13- 15]。然而,采用傳統方法分離出的真菌種類和數量卻很有限[16],難以全面和準確了解真菌群落的真實組成和分布情況。隨著分子生物學的快速發展,特別是高通量測序技術的應用,人們對土壤微生物的研究和認識日漸深入。大量研究表明環境選擇是微生物群落結構形成和變化的重要影響因素,土壤真菌適宜在酸性土壤中生長[17],對土壤濕度[18]、溫度[13,19]、養分含量[20-21]以及不同的土壤層環境[22]十分敏感,且不同林型對應著不同的優勢菌群[23],不同地區的主要影響因子也可能存在不同。研究林線土壤真菌群落結構組成的影響機制,將為神農架國家公園(Shennongjia National Park, SNP)的建設政策提供生態理論指導。

神農架國家公園是目前世界中緯度地區唯一保存完好的亞熱帶森林生態系統,其獨特的地理和氣候條件孕育了豐富的生物資源[24],具有明顯的高山林線過渡帶分布特征,為開展林線過渡帶微生物多樣性及其形成機制研究提供了理想的場所[12]。本研究選擇神農架國家公園中林線上、下的灌木林和針葉林為研究對象,采用Illumina高通量測序技術,旨在探討：(1)林線上、下的灌木林和針葉林的真菌群落結構組成情況;(2)影響林線過渡帶土壤真菌多樣性的主要環境因子。

1 研究方法

1.1 樣地設置與土壤樣品采集

神農架國家公園位于湖北省西北部神農架林區的西南部。神農架(31°15′—31°57′N,109°59′—110°58′E)的神農頂高達3105.4 m,為華中地區最高峰[25]。屬于亞熱帶季風氣候,四季變化明顯。年平均氣溫為7.2℃,年均降水量為1500 mm[26]。神農架國家公園具有典型的植被帶分布特征,從低海拔到高海拔分別為常綠闊葉林、落葉闊葉林、針闊混交林、針葉林和灌木林,其中灌木林植物蓋度較低且海拔分布為2736—2777 m,針葉林植物蓋度較高且海拔分布為2530—2590 m。在灌木林中,喬木層和灌木層的優勢植物物種分別是粉紅杜鵑(Rhododendronoreodoxa)和神農箭竹(Fargesiamurielae),在針葉林中的優勢植物物種是巴山冷杉(Abiesfargesii)。神農架國家公園的灌木林和冷杉林具有明顯的林線。

在神農架國家公園的灌木林和針葉林中分別設立采樣點,記錄各采樣點的海拔、坡度、植被等信息(表1)。在每個樣地,連續設置9個20 m×20 m的樣方,樣方之間間隔約20 m。每個樣方內以對角線五點取樣法設置5個5 m×5 m的小樣方,用土鉆(直徑4 cm)采集0—10 cm的土壤樣品10—15鉆,去除凋落物和碎石等,經過2 mm孔篩后分裝,帶回實驗室進行進一步分析或低溫保存備用。一部分(約100 g)置于-80℃超低溫冰箱,用于DNA提取,另一部分(約500 g)4℃保存,用于土壤理化性質測定。

表1 神農架國家公園土壤采集點基本情況

1.2 土壤理化性質和植物參數的測定

土壤理化性質采用常規方法進行測定[27]。包括pH計測定土壤pH,烘干法測定土壤含水量,水溶解法測定水溶性有機碳,凱氏定氮法測定全氮,堿解擴散法測定有效氮,離子體發光色譜儀測量全磷、速效磷含量。采用溫度探測儀測量土壤層10 cm溫度。分別調查兩個林型中的喬木層(胸徑 ≥ 5 cm)和灌木層(胸徑≤5 cm)的植物,記錄其種名、數量、高度、蓋度及多度等指標。

1.3 土壤微生物基因組DNA提取、純化和定量

利用試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(OMEGA, Bio-tek, USA)提取和純化土壤微生物DNA,通過NanoDrop ND- 1000分光光度計測量DNA溶液的濃度。DNA濃度和純度達到以下標準：每個DNA樣品濃度最低達25 ng/μL,滿足A260/280處于1.8—2.0之間且A260/230>1.7。

1.4 Illumina測序和測序數據預處理

本試驗通過Illumina測序平臺檢測rDNA ITS2基因片段序列,利用Galaxy平臺(http://mem.rcees.ac.cn:8080)對測序原始數據進行預處理,分析兩個樣地中的土壤真菌物種組成情況。

采用gITS7F(正向引物5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′)和ITS4R(反向引物5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC- 3′)[28]對真菌的ITS2區段進行擴增,其中反向引物中標有不同序列的Barcode,用于區分樣品。PCR擴增體系(50 μL)包括5 μL 10×Taq緩沖液,1.5 μL dNTP混合物,0.5 μL Taq酶,2 μL牛血清白蛋白(5 mg/mL,酶保護劑),1 μL正向引物,1 μL反向引物,1 μL DNA溶液(約25 ng/μL)和38 μL ddH2O。PCR反應條件為94℃預變性1 min,35個循環(94℃變性20 s, 56℃退火25 s,68℃延伸45 s),68℃終延伸10 min。利用3%的凝膠電泳檢測并回收DNA樣品,通過試劑盒E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit(OMEGA,Bio-tek,美國)純化DNA樣品,重新測量其濃度和純度。純化后的DNA樣品按照光密度值和濃度進行混合,Qubit定量,建庫,將混合樣品與PhiX于96℃變性2 min,置于冰水混合物中5 min,最后將樣品放入試劑盒MiSeq Reagent Kit(Illumina, San Diego, CA, USA)進行2×250 bp雙末端上機測序。

分別將原始序列文件以及樣品與Barcode對應文件上傳至數據平臺,區分樣品、去除引物(容納1.5%不匹配率)。按照Flash[29]算法拼接序列(最小重疊片段長度為30 bp)。利用Btrim刪除質量低于20的序列[19],Trim N刪除長度低于200 bp或含有模糊堿基的序列(N)。根據序列長度分布情況,將其剪切至240—350 bp。Uchime[30]去除嵌合體之后,按照Uclust算法和97%的相似度對可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)進行聚類分析。采用RDP classifier(50%可信度)在真菌ITS UNITE 數據庫中比對物種信息。本研究將每個樣品的OTUs之和標準化為10000,每個樣品的OTUs豐度為該樣品的單元格/10000的百分比。

1.5 數據分析

利用Excel對試驗數值進行初步分析;植被多樣性采用Shannon指數和Richness指數表征;真菌多樣性采用Shannon指數、Chao值和Richness指數表征;基于R 3.1.2的vegan包或者在線分析網站(http://www.ou.edu/ieg/)進行下列數據分析。通過除趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis,DCA)和不相似性檢驗(Dissimilarity test)檢測樣地的群落結構組成差異;利用皮爾遜相關性分析(Pearson correlation test)、典范對應分析(Canonical correspondence analysis,CCA)和Mantel分析,得出影響真菌群落結構組成的主要環境因子,其中CCA中為避免出現嚴重的共線性,要求環境因子的方差因子(Variance inflation factor,VIF)必須小于20[28];利用Origin 8.5作圖。利用IBM SPSS Statistics 21進行皮爾遜相關性分析和獨立樣本T檢驗。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和植物多樣性分析

從測得的土壤營養指標來看(表2),灌木林的土壤養分總體高于針葉林,全磷和有效磷含量具有顯著差異(P< 0.01),有機碳、可溶性有機碳、全氮和有效氮含量無顯著差異。在灌木林和針葉林樣地采集的土壤樣品均呈酸性,但針葉林土壤pH顯著高于(P< 0.001)灌木林土壤。與灌木林相比,針葉林土壤溫度偏低,濕度偏高,且溫濕度差異顯著(P< 0.001)。針葉林的胸徑、喬木層株高、灌木層植物密度、植物多樣性和物種數目顯著(P< 0.001)高于灌木林。

表2 土壤理化性質、植被多樣性和真菌多樣性指數

數據表示形式均為平均值±標準誤,P值通過獨立樣本T檢驗得出

2.2 土壤真菌群落結構和多樣性

圖1 灌木林和針葉林土壤真菌群落結構組成在門水平上的比較Fig.1 Comparison of the soil fungal community compositions in shrub and coniferous forests on level of phyla

通過Illumina測序,共得到2786條不同的ITS2區OTUs,樣本的序列條數分布在13547—40799之間。按照10000的值重新取樣,從灌木林土壤樣品中檢測出1288個OTUs,從針葉林土壤樣品中檢測出2027個OTUs。通過分析,發現這兩個樣地土壤中存在子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridimycota)和球囊菌門(Glomeromycota)等5個門的真菌,包括226個屬和553個種。在門水平上,擔子菌門(P= 0.003)和接合菌門(P= 0.002)的豐度在兩樣地之間差異極其顯著(圖1),壺菌門和球囊菌門的豐度不足1%,與未知菌門(Unclassified)歸為其他(Others)。在灌木林土壤中的優勢真菌為接合菌門(55.86%),優勢菌屬為被孢霉屬Mortierella(35.07%)(表3),優勢菌種為Mortierella_humilis|SH218044.06FU(26.15%)(表4);而在針葉林土壤中的優勢真菌為擔子菌門(67.38%),優勢菌屬為隱球菌屬Cryptococcus(27.12%),優勢菌種為Cryptococcus_terricola|SH215219.06FU(26.96%)。在擔子菌門中,針葉林土壤中的絲膜菌屬(Cortinarius)、絲蓋傘屬(Inocybe)、紅菇屬(Russula)和蠟殼耳屬(Sebacina)的豐度顯著高于灌木林。

針葉林土壤真菌的Shannon指數、Chao值和richness指數均顯著高于(P< 0.05)灌木林(表2)。DCA顯示兩個林型的真菌群落結構(β多樣性)差異顯著(圖2),不相似性檢驗(基于Bray-curtis和manhattan距離方法)進一步證實這兩個林型的真菌群落結構存在顯著差異(表5)。

上述結果表明,灌木林和針葉林在土壤真菌群落結構組成上存在顯著差異,且針葉林的土壤真菌多樣性顯著高于灌木林。

表3 兩種林型中相對豐度大于1%的土壤真菌屬

*表示獨立樣本T檢驗的P值 < 0.05,**表示獨立樣本T檢驗的P值 < 0.01;數值形式: 平均值±標準誤

表4 兩種林型中相對豐度大于1%的土壤真菌種

*表示獨立樣本T檢驗的P值 < 0.05,**表示獨立樣本T檢驗的P值 < 0.01. 數值形式: 平均值±標準誤

圖2 灌木林和針葉林土壤真菌群落組成除趨勢對應分析Fig.2 Detrended correspondence analysis of soil fungal community compositions in shrub and coniferous forests

2.3 影響土壤真菌群落變化的主要環境因子

通過CCA初步分析與真菌群落結構組成相關的環境因子,利用方差膨脹因子分析(VIF < 20)共選入7個環境因子：可溶性有機碳、土壤溫度、全磷、全氮、土壤pH、植物多樣性指數、土壤濕度。按照環境因子在CCA1軸的投影長度得知,土壤pH、植物多樣性、土壤溫度和土壤濕度是影響真菌群落組成的重要環境因子(圖3)。利用Mantel分析(表6),綜合R值和P值可以看出,土壤pH對土壤真菌多樣性的影響最高,植物多樣性次之,土壤濕度和土壤溫度對土壤真菌的類群也有明顯的影響。

表5 灌木林和針葉林的土壤真菌群落組成的不相似性檢驗

MRPP: 多響應置換過程分析, multiple response permutation procedure; Anosim, 相似性分析, analysis of similarities; Adonis, 多元方差分, permutational multivariate analysis of variance; Delta: 該組平均距離, the group mean distance; Bray-curtis, 布雷柯蒂斯距離方法, Bray-curtis diastance method; Manhattan: 曼哈頓距離方法, Manhattan distance method

表6 土壤真菌全部OTUs、重要真菌門與環境因子的Mantel分析

圖3 灌木林和針葉林土壤真菌群落組成與環境因子間的典范對應分析Fig.3 Canonical correspondence analysis between soil fungal community compositions and environmental factors in shrub and coniferous forestsDsoc: 水溶性土壤有機碳, dissolved soil organic carbon; Tem: 土壤溫度, soil temperature; TP: 全磷, total phosphorus; TN: 全氮, total nitrogen; pH: 土壤酸堿度; Mo: 土壤濕度, soil moisture; Plant Shannon: 植物香農指數, plant Shannon index

3 討論

通過對神農架國家公園灌木林和針葉林土壤真菌多樣性的分析,發現擔子菌門為針葉林土壤真菌的優勢類群。有研究表明,擔子菌門在土壤木質素含量較高的環境中占優勢,是最主要的分解者[31],本研究中針葉林植被多樣性指數較高,土壤中木質素相對較多,是擔子菌門的重要生存來源。絲膜菌屬(Cortinarius)、絲蓋傘屬(Inocybe)、紅菇屬(Russula)和蠟殼耳屬真菌(Sebacina)屬于外生菌根真菌,且在針葉林中豐度顯著高于灌木林。菌根真菌是植物菌根和真菌的共生體,在凋落物分解、養分循環和能量流動中具有重要作用[18],其聯結形成的網絡系統降低了不利物種的優勢地位,促進優勢擔子菌與針葉樹植物共生[32]。灌木林中土壤真菌的優勢真菌類群為接合菌門,與Wallenstein等研究結果一致[33]。被孢霉屬(Mortierella)是土壤習居菌,往往健康植物土壤中豐度更高[34],本研究發現該屬真菌為灌木林土壤優勢真菌,表明神農架國家公園灌木林土壤更健康。

植被的類型決定了凋落物數量和質量的不同[23]。除了微生物對土壤有機質的降解和轉化,植被類型的凋落物特點[35]及其對雨水的截留能力的不同,在一定程度上影響著土壤表層有機質含量的變化。針葉林中巴山冷杉等樹木的小型葉占優勢[36],凋落物積累量較低,導致針葉林對雨水的攔截能力相對較弱,土壤含水量高,土壤碳氮流失較多,與趙溪等結果一致[35]。而灌木林中粉紅杜鵑等樹木的葉片寬大,單位面積凋落物積累量較高,使灌木林具有較強的雨水攔截能力,土壤含水量較低,表層的有機物流失較少,土壤中碳氮含量較高。且針葉林植被葉表面含難降解的臘質,而灌木林的植被凋落物相對容易降解,產生有機質輸入土壤,維持灌木林土壤的碳氮含量,秦嘉海也表明祁連山的灌木林土壤有機質含量比當地針葉林高[37]。

土壤pH是影響真菌群落結構組成的重要環境因子,對土壤真菌的生長繁殖以及胞外酶的分泌均具有顯著影響[38]。真菌一般在酸性條件下占優勢[17-18],Nevarez等發現真菌生長最適pH為5.5[39]。本研究調查的兩個林型的土壤pH < 5.5,為酸性環境,適宜真菌生長。本研究也發現土壤真菌多樣性與pH值呈顯著正相關,與喬沙沙等研究相同[18]。

目前,關于植物多樣性與土壤真菌群落結構之間的相關性還沒有一致的定論。有研究表明,植物多樣性對土壤真菌群落結構在小尺度上具有很明顯的相關性,但在大尺度上相關性卻很低,這可能是在大尺度上氣候因子的影響掩蓋了植物因子的影響[40]。也有研究表明,植物多樣性與土壤真菌多樣性不相關[41],這可能是功能冗余[42]或者獨特的植物物種在物質循環中有重要作用[43]造成的。本研究中,CCA和Mantel分析顯示,真菌多樣性與植物多樣性呈顯著正相關關系。覆蓋土壤的不同植被類型影響土壤真菌多樣性,一方面是因為不同植被類型產生不同的根際分泌物,影響土壤真菌群落的組成和分布;另一方面是植物與某些土壤真菌具有共生關系,如菌根關系,從而提高了共生菌的豐度,但抑制了其他真菌的生命活動,從而影響真菌的群落組成多樣性[18, 23]。高林線的強烈太陽輻射對幼苗生長具有嚴重的限制作用[44],本研究中針葉林的喬木層胸徑、株高以及灌木層株數顯著高于灌木林,這可能是因為高海拔、低郁閉度的灌木林得到了較多的太陽輻射,且低溫條件下的強光造成的低溫光抑制作用降低了生長季的光合作用[5],其植物生長受到更多限制,而低海拔、高蓋度的針葉林則沒有受到強光造成的太大影響,形成針葉林的胸徑、株高和物種數目高于灌木林的結果,影響著土壤真菌多樣性。

森林林線過渡帶的形成一般與溫度存在很大關系[5],本研究顯示溫度與土壤真菌群落結構顯著相關,說明溫度也是控制林線處土壤真菌群落結構的重要環境因子,Ding等也認為溫度是控制林線處土壤細菌多樣性的主要環境因子[12]。林線處的郁閉林溫度比其臨近的高海拔林區溫度更低[8],本研究的灌木林的土壤溫度顯著高于較低海拔的針葉林,這可能與針葉林植株茂密程度顯著高于灌木林有關,灌木林郁閉度低,白天光照產生的熱量能較多存儲在土壤中,而高郁閉度的針葉林一定程度上阻擋了光照,熱量較難進入針葉林土壤層,晝夜溫差會比灌木林小,一定程度上可以維持和穩定土壤真菌的生命活性。溫度變化通常會改變微生物細胞酶的活性,影響細胞生長和分化機制,從而影響微生物多樣性[2, 19]。基于林線過渡帶在全球氣候變化中的重要指示作用,研究其地下微生物在氣候和土壤條件變化下的響應,為人們對凍害的防治和林線的動態預測提供了一定的理論依據。