硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿葉片抗氧化酶活性及產量的影響

田春麗, 李 斌, 劉 芳, 介曉磊, 劉世亮, 胡華鋒

(1. 河南農業大學資源與環境學院, 河南 鄭州 450002; 2. 河南農業職業學院, 河南 中牟451450; 3. 河南省農業廳中藥材生產技術服務中心, 河南 鄭州 450008; 4. 商丘師范學院, 河南 商丘 476000; 5. 河南牧業經濟學院, 河南 鄭州 450011)

硒對植物的影響是多方面的，兼具營養和致毒等多重效應[1]。隨著生物膜理論和自由基傷害學說研究的進展，硒對植物的抗氧化作用成為近幾年的研究熱點。硒是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)成分及其家族活性部位的輔基，具有清除過氧化物、延緩細胞衰老、防止細胞損傷等作用[2]。硒的生物抗氧化作用通過酶促機制和非酶促機制參與自由基清除系統而產生抗氧化功能，酶促系統主要包括一些抗氧化相關的酶，非酶促系統包括一些非酶類的抗氧化相關物質。現有實驗證明，硒對不同植物、不同器官和不同發育階段的抗氧化酶的影響都有差異，Djanaguiraman等[3]發現，適宜濃度的硒酸鈉噴施大豆(GlycinemaxL.Merr)葉片后，促進了葉片GSH-Px和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)的活性；Xue等研究表明低硒處理對SOD和過氧化物酶(peroxidase，POD)具有誘導效應，土壤添加0.1 mg·kg-1H2SeO4可以提高盆栽萵苣(LactucasativaL.)幼葉和老葉的GSH-Px活性，及老葉中的SOD活性，降低幼嫩葉片的SOD活性[4]。王明洋等[5]研究表明，杏鮑菇(Pleurotuseryngii)子實體GSH-Px、SOD、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性在培養料硒含量為40～50 mg·kg-1范圍內時顯著增強，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量明顯降低。賈宏昉[6]研究表明噴硒可提高烤煙(NicotianaL.)煙葉GSH-PX、SOD及POD的含量，降低CAT的活性及MDA和游離脯氨酸(proline,Pro)的含量，進而調節烤煙體內抗氧化系統的動態平衡。

鋅是許多酶的活化劑，同時具有消除超氧自由基的毒害作用、緩解外界脅迫的能力[7]。很多研究表明，硒、鋅對作物的生長發育及品質有明顯的影響，適量的硒、鋅可通過提高某些抗氧化酶活性來增強作物的抗性和提高產量，并有效改善品質。腐殖酸富啡酸(fulvic acid，FA)作為植物的營養元素及其載體在農業生產中具有特殊作用，其富含羧基、酚羥基、醇羥基和醌基等多種含氧官能團，對金屬離子有較強的絡合和螯合能力，可通過活化土壤中非有效態、改變重金屬向根的擴散速度、調節植物對元素的吸收等方面而促進植物對重金屬的吸收[8]。Kumar等[9]研究表明富啡酸促進了土壤鋅向可溶性鋅配合物的轉化，進而顯著提高鋅在石灰性土壤中有效性。硒是兩性元素，易與富啡酸絡合產生低分子量的硒-富啡酸螯合物來提高動植物對硒的生物利用度。為此，本試驗以硒富集作物紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為研究對象，針對石灰性潮土硒、鋅低含量和低活性特點，采用大田小區試驗，通過將外源硒、鋅和富啡酸施入土壤，研究其對紫花苜蓿葉片抗氧化酶活性和產量的影響，旨在為紫花苜蓿生產中合理施用硒鋅微肥，為開發富硒富鋅紫花苜蓿提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地土壤概況

試驗地點位于河南省農業高新科技園區(34°47′1" N，113°39′28" E，海拔95.1 m)，屬于北暖溫帶大陸季風性氣候，年平均氣溫14.3℃，1月日均溫1.5℃(最低-20℃)，7月日均溫27.5℃(最高40℃)，≥10℃有效積溫4 700～5 000℃，平均年降雨量630 mm，無霜期220～225 d。試驗地土壤為潮土，質地輕壤，肥力中等。土壤有機質含量為10.7 g·kg-1，堿解氮為55.2 mg·kg-1，有效磷(P2O5)為11.5 mg·kg-1，速效鉀(K2O)為85.0 mg·kg-1，有效鋅為0.64 mg·kg-1，有效硒為0.008 mg·kg-1。劉錚曾指出，土壤硒含量≤0.02 mg·kg-1時為嚴重缺硒，鋅含量為0.5～1.0 mg·kg-1之間為缺鋅[10]，可見該區土壤屬于嚴重缺硒缺鋅土壤區。

1.2 試驗材料

供試紫花苜蓿品種為三得利，該品種是從美國引種的優質牧草品種之一，其春季返青早，生長迅速，夏秋季生長旺盛，再生速度快，產量高；莖稈柔嫩、適口性好、蛋白質含量高、消化率好；抗凍害能力強，秋眠級數4.0，且抗病蟲害和抗倒伏能力強，具有很高的社會經濟效益。

供試肥料分別為：尿素[CO(NH2)2，含N 46%]，硫酸鉀(K2SO4，含K2O 50%)，過磷酸鈣(含P2O512%)，七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O，AR)，亞硒酸鈉(Na2SeO3，AR，含硒量為45.6%)。富啡酸由河南省化學研究所提供(純度≥50%)。

1.3 試驗設計

共設對照(CK，不施肥)、施氮磷鉀(NPK)、增施富啡酸(NPK+FA)、增施復合微肥(鋅和硒)(NPK+Zn+Se)、增施富啡酸和復合微肥(鋅和硒)(NPK+FA+Zn+Se)等5個不同施肥處理，隨機區組排列，重復3次，共15個小區。小區面積為4 m × 3 m。

試驗開始前，將氮、磷、鉀肥料和微量元素肥料集中混勻，均勻撒施于小區土壤表面，人工翻耕20 cm左右。肥料施用量為：N：90 kg·hm-2，P2O5：120 kg·hm-2，K2O：105 kg·hm-2，Zn(ZnSO4·7H2O)15 kg·hm-2、Se(Na2SeO3)0.60 kg·hm-2、富啡酸用量90 kg·hm-2。

整地施肥后于2015年10月上旬播種，播種行距30 cm左右，播深1.5～2 cm，埂寬30 cm，各區組間過道寬50 cm。播種量為15 kg·hm-2，播后鎮壓保墑，出苗后注意補苗。生長期間按大田種植模式管理。

1.4 測定項目與方法

1.4.1紫花苜蓿部分生理指標的測定 于紫花苜蓿前兩茬初花期(第一茬刈割時間為2016年5月23日，第二茬刈割時間為6月22日)選擇長勢一致、無病斑、光照均一的同一葉位(從頂部向下第6片完全展開葉)的紫花苜蓿葉片進行取樣，并以其三出復葉中間小葉作為的代表葉片進行生理生化指標測定。

生理生化指標采用李合生的方法進行測定[11]：葉片游離脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸提取法測定；MAD含量采用硫代巴比妥法測定；POD活性采用愈創木酚法測定；CAT活性采用紫外吸收法測定；SOD活性采用氮藍四唑光還原法測定；葉綠素含量采用乙醇比色法測定。

1.4.2紫花苜蓿產量測定 于初花期刈割采樣(刈割時間同上)。根據文獻[12]的方法，在每小區中選取三行長勢均勻的樣點，每行1.1 m，折合為1 m2，刈割時留茬5 cm，刈割后稱取其重。從所取新鮮樣品中隨機取150 g，為了減少鮮樣外表吸附外物對分析造成的誤差，先用自來水沖洗，再用去離子水沖洗干凈，用粗濾紙擦干，于105℃殺青15 min后，于65℃烘干至恒重，計算含水量及干草重，之后折合為1 hm2的干草重即為草產量[12]。

1.5 數據分析

使用SPSS 12.0統計軟件，采用F測驗和LSD法對試驗數據進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同處理對紫花苜蓿葉片中POD活性的影響

由表1可知，在兩茬中均以NPK+FA處理紫花苜蓿葉片內POD的活性最高，其次是NPK+FA+Zn+Se處理。在第一茬中，NPK+FA與NPK+FA+Zn+Se兩者之間無顯著差異，但顯著地高于其他3個處理；在第二茬中，各處理POD活性的大小為：NPK+FA > NPK+FA+Zn+Se > NPK+Zn+Se > NPK > CK，且各處理間差異明顯，說明在氮磷鉀充足時，單施FA比其它處理更能提高紫花苜蓿POD活性，從而維持紫花苜蓿體內活性氧代謝平衡，從而更好地清除過量活性氧，提高其抗氧化能力，也說明基施硒鋅對紫花苜蓿葉片POD活性影響不顯著。

表1 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿POD活性的影響Table 1 Effects of Se-Zn and FA combined application on POD activities of alfalfa leaves/g·FW·min-1

注：同列數字標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

Note:Means with different letters in the same column are significantly different at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同處理對紫花苜蓿葉片中SOD活性的影響

由表2可知，硒鋅與富啡酸配施可顯著提高紫花苜蓿葉片中SOD的活性，兩茬中SOD活性大小順序均如下：NPK+FA+Zn+Se > NPK+Zn+Se > NPK+FA > NPK > CK，即均以NPK+FA+Zn+Se處理紫花苜蓿葉片內SOD的活性最大，在第一茬和第二茬中該處理分別比CK高出8.48%、6.49%，且與其他處理均達到顯著差異。說明硒鋅與富啡酸配施能顯著提高紫花苜蓿葉片中SOD的活性，同時硒-鋅復合微肥也能顯著提高葉片中SOD活性，即增強紫花苜?？寡踝杂苫竞Φ哪芰ΑＭ瑫r可以看出，第一茬各個處理SOD的活性均明顯高于第二茬，紫花苜蓿SOD活性逐漸降低可能與植株體內硒含量有關，劉芳等[13]研究表明適量基施硒可提高紫花苜蓿葉片中SOD活性，但如果施硒量超過一定量其SOD活性則有降低趨勢，且隨生育期延長，可能影響了機體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的合成，致使SOD活性逐漸降低。

表2 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿SOD活性的影響Table 2 Effects of Se-Zn and FA combined application on SOD activities of alfalfa leaves/g·FW·min-1

2.3 不同處理對紫花苜蓿葉片中CAT活性的影響

由表3可以看出，施肥可顯著提高紫花苜蓿葉片中CAT活性。和對照CK相比，NPK+FA+Zn+Se處理效果最顯著，NPK+Zn+Se和NPK+FA處理次之，隨后是NPK處理。兩茬中均以NPK+FA+Zn+Se處理紫花苜蓿葉片內CAT的活性最大，在第一茬和第二茬中該處理分別比CK高出60.18%、101.65%，且與其它處理均達到顯著差異。說明在富啡酸施用條件下，適量硒鋅進入植物體內增強了紫花苜蓿的抗氧化能力，進而提高植物的抗逆性和抗衰老能力，保證其正常生長，這與硒鋅提高了植株體內的過氧化氫酶活性有直接關系。NPK+Zn+Se與NPK+FA處理的CAT活性也有顯著提高，但第一茬兩者之間無顯著差異，第二茬才達到顯著差異，說明氮磷鉀和硒鋅配施比氮磷鉀與富啡酸配施更能提高紫花苜?？寡趸芰?，即硒鋅對提高苜蓿CAT活性效果更顯著。

表3 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿CAT活性的影響Table 3 Effects of Se-Zn and FA combined application on CAT atcivities of alfalfa leaves/g·FW·min-1

2.4 不同處理對紫花苜蓿葉片游離Pro含量的影響

由表4可知，除NPK處理外，各施肥處理均顯著提高紫花苜蓿葉片內游離脯氨酸含量，并均與CK達到顯著差異，說明硒鋅與富啡酸單施或配施均有助于紫花苜蓿葉片通過積累脯氨酸來增強葉片的滲透調節能力，維持細胞正常膨壓，進而提高其對外界環境的抗性。

在第一茬和第二茬中均以NPK+FA+Zn+Se處理紫花苜蓿葉片內游離脯氨酸含量最高，分別比對照高出37.84%和58.06%；其次是NPK+FA處理，分別比對照高出18.92%和22.58%，但在第一茬中NPK+FA+Zn+Se與NPK+FA處理間差異不顯著，第二茬兩者才表現出差異；再次是NPK+Zn+Se處理，在兩茬中均與其余所有處理差異顯著，說明基施硒和鋅可顯著提高苜蓿葉片脯氨酸含量，但效果不如富啡酸單施或與富啡酸配施明顯。

表4 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿游離Pro含量的影響Table 4 Effects of Se-Zn and FA combined application on proline content of alfalfa leaves/mmol·kg-1

2.5 不同處理對紫花苜蓿MDA含量的影響

由表5可看出，在第一茬和第二茬中CK處理的紫花苜蓿葉片MDA含量最高，但所有施肥處理葉片中MDA含量與CK間差異均不顯著，但FA有降低葉片MDA含量的趨勢。徐云等[14]研究表明，適量補硒可降低MDA的產生，但他們采用水培方法，本研究采用基施方法在大田進行，土壤中的影響因素很復雜，可能由于試驗方法不同影響到硒、鋅的吸收，進而影響苜蓿體內的生理反應造成MDA的含量產生差異。

表5 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿MDA含量的影響Table 5 Effects of Se-Zn and FA combined application on MDA content of alfalfa leaves/μmol·kg-1

2.6 不同處理對紫花苜蓿干草產量的影響

從表6可知，與對照(CK)相比，各施肥處理均提高了紫花苜蓿草產量。兩茬均呈現出NPK+FA+Zn+Se > NPK+FA > NPK+Zn+Se > NPK > CK的趨勢。即均以NPK+FA+Zn+Se增產效果最為明顯，且均與CK達到顯著差異。

在第一茬中，NPK+FA+Zn+Se處理紫花苜蓿產量最高，達到4.69 t·hm-2，顯著高出對照CK 1.75 t·hm-2；其次是NPK+FA處理，產量為4.23 t·hm-2，比對照CK高出1.29 t·hm-2。同時可以看出，雖然NPK+FA與NPK+Zn+Se間無顯著性差異，但NPK+FA的增產效果比NPK+Zn+Se高，說明在充足施用氮磷鉀后，富啡酸的施用比硒和鋅配施增產效果更明顯，表明FA可通過螯合作用活化土壤中的硒、鋅，減少其固定作用，促進紫花苜蓿對Zn和Se的吸收，并對苜蓿的生長發育產生顯著作用。

第二茬中，仍以NPK+FA+Zn+Se處理干草產量達到最大，為3.26 t·hm-2，且NPK+FA+Zn+Se和NPK+FA間草產量達到顯著差異，分別較對照CK增產52.3%和25.7%，但其他處理間均無顯著性差異。同樣說明在施用適量FA時，Zn和Se對促進紫花苜蓿的生長發育產生更顯著作用。同時可以看出，第二茬紫花苜蓿產量明顯低于第一茬，主要是在第一茬收獲后，試驗基地降雨量明顯減少，而且紫花苜蓿出現了輕微病害，雖然當時采取了相應的防治措施，但仍不同程度地降低了其產量，所以NPK+Zn+Se與NPK較CK處理無顯著性差異，施肥效果不明顯。

表6 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿干草產量的影響Table 6 Effects of Se-Zn and FA combined application on hay yield of alfalfa/ t·hm-2

3 討論

3.1 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿葉片抗氧化酶活性的影響

3.2 硒鋅和富啡酸配施對紫花苜蓿產量的影響

劉錚認為我國2/3地區屬缺硒地區，其中含量≤0.02 mg·kg-1的占29%，為嚴重缺硒地區[10]，從而嚴重影響紫花苜蓿等牧草的生長和產量的提高，并激發了研究人員通過施用硒等微量元素肥料來提高其產量的研究。Hu等[23]研究表明，適量硒可促進紫花苜蓿生長，增加產量，并可生產富硒紫花苜蓿產品；翁伯琦等[24]在圓葉決明(Chamaecristarotundifolia)的研究表明，施硒能提高其生長、改善品質，并顯著提高產量。另有研究表明，鋅作基肥能提高紫花苜蓿當年的產量，缺鋅會嚴重影響紫花苜蓿產量和品質，田春麗等研究表明，硒鋅基施不僅能顯著提高紫花苜蓿的抗逆性，并顯著提高其草產量[25]?？梢?，硒鋅在植物營養方面都能夠刺激植物生長，調節葉綠素的合成，增強植物抗氧化作用，促進產量和質量的提高。本試驗地土壤屬于嚴重缺硒缺鋅土壤，通過采取施肥措施，有明顯的增產效果，總體有NPK+FA+Zn+Se > NPK+FA > NPK+ Zn+Se > NPK > CK的趨勢，兩茬均以NPK+FA+Se+Zn處理產量最高，第一茬和第二茬產量分別為4.69 t·hm-2和3.26 t·hm-2，較對照增幅分別為59.5%和52.3%，表明在基施氮磷鉀的條件下，富啡酸與微肥(硒和鋅)配施的增產效果最好，且富啡酸的施用比微肥(硒和鋅配合)施用的效果更好，出現這種效果也與NPK+Zn+Se與NPK+FA能顯著提高紫花苜蓿葉片POD、SOD、CAT活性及Pro含量(表1～4)有關，這樣可有效減輕活性氧等不利因素對其的傷害，延遲葉片衰老，提高紫花苜?？鼓嫘裕ＷC苜蓿的正常生長，從而提高紫花苜蓿產量，這也可能與富啡酸的生理功能有關，它能刺激植物根系的生長及提高根系活力，加強根系對水分和養料的吸收和運轉，使苜蓿生長健壯和產量增加[26]，且富啡酸可促進微量元素的吸收和運輸，達到提高作物產量和品質的作用。因石灰性土壤中硒和鋅大部分都被固定，所以基施硒和鋅的效果不如富啡酸與微肥(硒和鋅)配施明顯，但基施硒和鋅仍有增產效果。由此可見，生產中適量施用鋅硒或富啡酸均可提高苜蓿產草量，進而提高苜蓿的經濟價值。

4 結論

對于葉片POD活性，兩茬中均以NPK+FA處理最高，其次是NPK+FA+Zn+Se處理，說明在氮磷鉀供應充足時，富啡酸(FA)比微肥(Se +Zn)更能有效提高苜蓿葉片POD活性，而硒鋅對其活性影響不顯著；基施硒鋅與富啡酸可顯著提高紫花苜蓿葉片內游離Pro含量、CAT及SOD活性，而且硒鋅與富啡酸配合施用效果更好，說明在富啡酸施用條件下，適量硒鋅進入植物體內增強了紫花苜蓿的抗氧化能力，進而提高植物的抗逆性和抗衰老能力，保證其正常生長；但各施肥處理對MDA無顯著影響。

通過施肥可顯著提高苜蓿產量，在刈割第一茬時，以NPK+FA+Se+Zn處理產量最高，高達4.69 t·hm-2，其次是NPK+FA處理，再次為NPK+Se+Zn與NPK處理，說明在充足氮磷鉀條件下，適量硒鋅微肥或富啡酸均能顯著提高苜蓿產量，且微肥和富啡酸配施效果最好，但單獨基施硒鋅混合微肥對石灰性土壤上苜蓿的增產效果并不明顯，進一步說明富啡酸可以活化了土壤中的硒、鋅，促進紫花苜蓿的生長發育，提高產量。