福鼎大白茶高效離體再生體系的優(yōu)化

吳婉婉 ，孫威江 ，陳志丹

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，350002；2.陜西果業(yè)集團(tuán)有限公司，710000；3.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，350002；4.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，350002；5.福建省茶產(chǎn)業(yè)行業(yè)技術(shù)開發(fā)基地，350002

茶樹組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，英國(guó)劍橋大學(xué)以茶樹幼嫩莖段為離體材料研究離體咖啡堿的合成[1]。我國(guó)茶樹組織培養(yǎng)研究起步較晚，但近年來(lái)也取得了顯著進(jìn)展。袁地順等[2]用福云6號(hào)和福鼎大毫茶2個(gè)茶樹品種的根尖和莖尖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)兩者都能誘導(dǎo)出愈傷組織，其中嫩莖的誘導(dǎo)效果較好。陳玉玲等[3]分別用茶樹葉片、莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于葉片，最佳的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS+0.4 mg/L 6-BA+2 mg/L 2，4-D。江昌俊等[4]用茶樹成熟胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，先誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽，最后誘導(dǎo)芽長(zhǎng)根，試驗(yàn)得出6-BA、2，4-D誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量較好，最高出愈率可達(dá)97%。彭正云等[5]以大田茶樹的根作為組織培養(yǎng)的外植體，誘導(dǎo)其先產(chǎn)生愈傷組織，再分化出發(fā)狀根。李家華等[6]以云南地區(qū)大葉種茶樹帶腋芽新梢誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腋芽和愈傷組織的最佳培養(yǎng)基分別是：MS+0.5 mg/L 6-BA+4 mg/L 2，4-D 和MS+10 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

福鼎大白茶是我國(guó)目前推廣面積最大、綜合性狀優(yōu)良的茶樹品種，也是最通用的茶樹遺傳資源[7]，但目前尚未見該品種完整再生體系的系統(tǒng)研究。試驗(yàn)以福鼎大白茶幼嫩莖段為材料，主要研究了不同激素組合對(duì)腋芽的誘導(dǎo)等，找出適合腋芽誘導(dǎo)、增殖和生根的最佳培養(yǎng)基，以便獲得完整的再生植株，為珍稀茶樹種質(zhì)資源的離體保存及茶葉科研提供基礎(chǔ)和高純度無(wú)菌材料。

一、材料與方法

1.材料與試劑

以春、秋季生長(zhǎng)帶飽滿腋芽的福鼎大白茶莖段為材料。

主要試劑：95%無(wú)水乙醇、氯化汞等。

儀器設(shè)備：電磁爐、自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋G154DS（致微廈門儀器有限責(zé)任公司）、純水器、超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）、接種器具消毒器（上海稼豐園藝用品有限公司）。

2.試驗(yàn)方法

（1）材料預(yù)處理

將所采集的用于腋芽誘導(dǎo)的材料剪去葉片和上、下端較嫩和較老的部分，留中間帶2～3個(gè)腋芽長(zhǎng)度的莖段，將材料置于燒杯中，先用洗衣粉水浸泡3～5 min，清洗掉表面塵土污垢（必要時(shí)用軟毛刷輕輕刷材料的表面），倒掉洗衣粉水，在燒杯上面蒙上紗布，自來(lái)水下沖滴1.0～1.5 h，再用蒸餾水沖洗1遍，在燒杯外噴灑酒精，后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)（超凈工作臺(tái)事先進(jìn)行紫外燈滅菌25 min左右），備用。

（2）腋芽誘導(dǎo)

消毒處理后的材料切成0.5 cm長(zhǎng)帶1個(gè)腋芽的莖段，接種于含有不同濃度激素（6-BA、NAA）的培養(yǎng)基上，試驗(yàn)采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次，20 d后調(diào)查并記錄萌芽率和生長(zhǎng)狀況。

萌芽率∕%=（萌芽外植體個(gè)數(shù)∕接種外植體總個(gè)數(shù)）×100

（3）不定芽增殖

以初代培養(yǎng)外植體萌發(fā)的小芽為材料，留1～2片葉子切下，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。主要探討不同激素6-BA （0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L）、NAA（0.1 mg/L、0.5 mg/L）的濃度組合對(duì)福鼎大白茶不定芽增殖的影響。

（4）生根培養(yǎng)

以增殖培養(yǎng)后高度大于2 cm的茶苗為材料，在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，探索不同激素組合對(duì)生根的影響。試驗(yàn)以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加瓊脂6.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH值5.6～5.8，并添加不同質(zhì)量濃度的IBA（0.25 mg/L、0.50 mg/L、0.75 mg/L、 0.10 mg/L）和 NAA （0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L）來(lái)誘導(dǎo)生根。試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，50 d后調(diào)查生根率、平均發(fā)根數(shù)和平均根長(zhǎng)。

生根率∕%=（生根數(shù)∕接種數(shù)）×100

（5）練苗移栽

在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，將組培苗帶瓶子一起置于通風(fēng)的室內(nèi)練苗。練苗后將整株小苗從培養(yǎng)瓶中取出植入事先準(zhǔn)備好的砂質(zhì)黃土中。

二、結(jié)果與分析

1.不同激素組合對(duì)福鼎大白茶腋芽誘導(dǎo)的影響

福鼎大白茶外植體接種后第二、第五、第七周的生長(zhǎng)狀況如圖1。從圖1可見，外植體接種后第二周后腋芽開始萌發(fā)，接種后第五周腋芽展開2片真葉，接種后第七周腋芽展開3片真葉。

圖1 福鼎大白茶外植體接種后第二周（左）、第五周（中）、第七周（右）的生長(zhǎng)狀況

對(duì)不同的6-BA、NAA質(zhì)量濃度配比對(duì)外植體腋芽誘導(dǎo)結(jié)果如表1。從表1中可知，6-BA、NAA、瓊脂3個(gè)因素對(duì)萌芽率的影響依次為：6-BA＞NAA＞瓊脂。方差分析結(jié)果表明，6-BA對(duì)誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)效果最為顯著，芽體生長(zhǎng)正常，NAA和瓊脂的作用不顯著。由此可得出誘導(dǎo)茶樹腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基組合為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂。

2.不同激素組合對(duì)福鼎大白茶不定芽增殖的影響

對(duì)不同的6-BA、NAA濃度配比對(duì)外植體不定芽增殖效果進(jìn)行鄧肯多重比較，結(jié)果見表2。

從表2中可見，不同的6-BA、NAA濃度配比對(duì)外植體不定芽的增殖有顯著性差異。Z3、Z5處理與其他各處理間增殖倍數(shù)達(dá)到極顯著性差異。Z3和Z5處理間也存在極顯著性差異，其中Z3處理的增殖倍數(shù)達(dá)到4.0，Z5處理的增殖倍數(shù)為1.9。其中，Z3處理外植體不定芽增殖培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)狀況如圖2。

表1 腋芽誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 Z3處理外植體不定芽增殖培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)狀況

表2 不定芽增殖倍數(shù)的鄧肯多重比較

總體來(lái)看，Z3和Z5處理的培養(yǎng)基較適合不定芽的增殖，且芽的生長(zhǎng)狀況也較其他處理的好，也就是當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA質(zhì)量濃度為1.0～1.5 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，較適合不定芽的增殖。

3.不同激素組合對(duì)組培苗生根的影響

將組織培養(yǎng)獲得的無(wú)根小苗接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d左右，在基部產(chǎn)生白色點(diǎn)狀突起，50 d時(shí)肉眼可看到白色的根伸出。不同IBA、NAA激素配比處理對(duì)組織培養(yǎng)苗根的誘導(dǎo)效果見表3。

表3 不同激素配比處理對(duì)組織培養(yǎng)苗根的誘導(dǎo)效果

從表3中可以看出，只有S4、S5培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)組織培養(yǎng)苗長(zhǎng)出根（圖3），其他培養(yǎng)基對(duì)組織培養(yǎng)苗根的誘導(dǎo)效果為0。其中，S4的平均生根率為11.11%，平均根長(zhǎng)1.4 cm；S5的平均生根率為77.78%，平均根長(zhǎng)達(dá)5.4 cm，根粗壯。

圖3 福鼎大白茶組培苗生根培養(yǎng)發(fā)根狀況

由此可知，最適的誘導(dǎo)茶樹組織培養(yǎng)苗生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA，附加瓊脂6.5 g/L，pH值調(diào)至5.6～5.8。

4.組培苗生根后的練苗移栽

組培苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，待不定根長(zhǎng)度＞3 cm時(shí)，開始進(jìn)行練苗。先將組培苗帶瓶子一起置于通風(fēng)的室內(nèi)練苗3～5 d，之后，再將瓶蓋旋開練苗2 d，最后將整株小苗從培養(yǎng)瓶中慢慢取出，用自來(lái)水輕輕地將附在根部的瓊脂培養(yǎng)基沖洗干凈，植入事先準(zhǔn)備好的砂質(zhì)黃土中，避免殘留的培養(yǎng)基引發(fā)雜菌的滋生，盡量避免傷到組培苗的根。移栽后將其放置在室內(nèi)靠窗位置，以利于通風(fēng)，同時(shí)應(yīng)根據(jù)天氣情況適時(shí)澆水。

三、結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)不定芽分化、增殖有較顯著的作用。通常情況下，較高濃度的細(xì)胞分裂素與較低濃度的生長(zhǎng)素配合使用，有利于芽的分化；相反，當(dāng)二者的比值高時(shí)，則有利于愈傷組織的形成和根的分化[8]。本研究得出誘導(dǎo)芽的較適培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，外植體已經(jīng)選定，接下來(lái)的主要工作就是培養(yǎng)基以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇。常用的培養(yǎng)基有MS、WPM、B5等[9]。茶樹屬于木本植物，對(duì)木本植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，通常采用的是MS培養(yǎng)基或在其基礎(chǔ)上加以改良。如郭玉瓊等[10-11]、袁正仿等[12]以茶樹帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行茶樹離體培養(yǎng)時(shí)，先在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出腋芽，再在1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出根，最后獲得完整植株。試驗(yàn)得出最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率可達(dá)77.78%，平均根數(shù)4條，平均根長(zhǎng)為5.4 cm。