小鼠胰島結合生物膠經皮下移植治療小鼠糖尿病的研究

王佳微 傅紅興 趙應征 楊麗斌 耿武軍

【摘要】目的 將含bFGF的生物膠與小鼠胰島細胞團結合，與不含bFGF生物膠的胰島細胞團對比研究bFGF對糖尿病小鼠胰島皮下移植后的療效，并進行功能性評價。方法 將分離、純化、培養(yǎng)后的胰島細胞與含有bFGF的生物膠結合移植到小鼠的皮下，將移植后皮下組織進行HE染色和免疫組化染色。同時與不含bFGF生物膠的皮下胰島移植相比較。結果 含bFGF生物膠的胰島細胞團經皮下移植與不含bFGF生物膠的小鼠胰島細胞團相比，小鼠血糖有所下降，但持續(xù)時間并不久，療效不是十分顯著。結論 含bFGF透明質酸鈉膠與胰島共移植，可以在一定程度上促進胰島移植后微血管重建。

【關鍵詞】糖尿病小鼠；胰島移植；堿性成纖維生長因子；透明質酸鈉膠

【中圖分類號】R587 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.18..02

bFGF是堿性成纖維細胞生長因子，是體內已知的作用最強的促血管生長因子[1]。本實驗通過有無結合含bFGF的生物膠與胰島細胞團共移植的比較，監(jiān)測血糖和體重變化，并且通過HE染色和免疫組化染色進行組織學評價，探測bFGF在體內對小鼠胰島微血管修復的影響及通過血管修復對于控制血糖的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Balb/c小鼠10只，體重約22 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和實驗器材

Ⅴ型膠原酶（Sigma公司，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066培養(yǎng)液（溫州怡康細胞移植技術開發(fā)有限公司，中國）；Hanks液（自配）；胎牛血清（四季青公司）；二乙酸熒光素（FD）（Sigma公司）；Anti-Insulin（Abcam公司）；bFGF（浙江格魯斯特生物科技有限公司）；透明質酸鈉（湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 60 ng/mL bFGF透明質酸鈉膠制備

（1）精密稱取20 mg透明質酸鈉粉末至1支4 mL無菌的EP管中，蓋子不用蓋緊，將其用紗布包裹后放入滅菌盒中；（2）將其置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌時間為5～10 min；（3）將滅菌好的裝有透明質酸鈉粉末的EP管置于超凈工作臺中，向此EP管中加入2 mL 60 ng/mL bFGF細胞培養(yǎng)液，攪拌均勻使其成半流動性凝膠狀，即得到10 mg/mL含60 ng/mL bFGF透明質酸鈉膠；（4）用封口膜封口后置于4℃冰箱過夜保存，以去除配制中產生的氣泡。

1.2.2 ICR小鼠皮下移植

（1）將準備移植的糖尿病小鼠在移植前20 min皮下注射50 μL頭孢唑啉鈉，小鼠采用持續(xù)吸入異氟烷麻醉；（2）待小鼠麻醉后，剃去腹股溝處周圍毛發(fā)，暴露的皮膚用酒精擦拭消毒，用眼科剪剪開外皮，用鑷子輕柔提起里面的肌肉層，剪開肌肉層后，用1 mL注射器針頭在皮下輕輕刺破一個小孔，在體視顯微鏡下，將準備好的胰島通過小孔緩緩注射入皮下，注射充分后緩緩拔出注射器并用鑷子輕輕夾住注射部位的小孔，以防胰島細胞溢出；（3）待出血停止后輕輕提拉肌肉層，縫合傷口，縫合時先第一針四個外科手術結固定，然后連續(xù)縫針，最后一針再與上一針進行四個外科手術結固定，剪掉多余線；（5）小鼠放回籠子，1 min左右小鼠即蘇醒，整個手術過程約20 min。

1.2.3 術后消炎及血糖監(jiān)測

術后每8 h皮下注射50 μL或每12 h注射100 μL頭孢唑啉鈉抗炎，持續(xù)一周，防止炎癥因子對胰島移植物的影響。手術后6、12、24、48 h測定血糖，之后每周測定一次血糖，直至血糖超過11.1 mmoL/L后宣告移植物失效，記錄術后血糖和體重的變化。

2 結 果

2.1 移植后血糖監(jiān)測結果

通過血糖變化曲線（圖1）可知，加生物膠的移植組比不加生物膠的移植組起效時間持久。由體重變化曲線（圖2）可知，加生物膠的移植組比不加生物膠的移植組體重增加的速率稍快。

2.2 HE染色和免疫組化染色結果

各實驗組在移植后10天將移植部位的皮膚組織取下，通過HE染色和免疫組化來評價含bFGF生物膠移植的實驗組中皮下胰島的形態(tài)和Insulin的表達，結果如圖3所示。

在結果（圖3-A）HE染色中可知，胰島數目不是很多，而且形態(tài)不是很完整。在免疫組化結果B中可看出，皮下組織存在的Insulin陽性細胞較少。

3 討 論

本實驗通過有無結合含bFGF的生物膠與胰島共移植比較，監(jiān)測血糖和體重變化，并且通過HE染色和免疫組化染色進行組織學評價，探測了bFGF在體內對小鼠胰島皮下移植療效的影響。通過實驗可知，盡管皮下移植的療效并不理想，胰島可能因各種原因引起凋亡而失活[2]，但可避免在初期因血液介導的炎癥反應（IBMIR）加含bFGF的生物膠的移植組血糖控制效果優(yōu)于不加含bFGF的生物膠的移植組。也說明，bFGF能夠改善胰島移植的相關功能指標。

參考文獻

[1] Li W，Zhao R，Liu J，et al.Small Islets Transplantation Superiority to Large ones：Implications from Islet Microcirculation and Revascularization.J Diabetes Res 2014，2014：192093.

[2] Yin N，Han Y，Xu H，et al.VEGF-conjugated Alginate Hydrogel Prompt Angiogenesis and Improve Pancreatic Islet Engraftment and Function in Type 1 Diabetes.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2016，59：958-964.

本文編輯：趙小龍