羥基磷灰石碳納米管對骨髓間充質干細胞的毒性作用及多向分化的影響

宋國棟 郭小雙 宗憲磊

[摘要] 目的 制備羥基磷灰石修飾的多壁碳納米管（HA-MWCNTs），探索HA-MWCNTs對大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的毒性作用及其多向分化能力的影響，為HA-MWCNTs在組織工程中的應用提供試驗依據。 方法 制備HA-MWCNTs，通過透視電鏡、X線衍射分析其微觀形態；取體重100～150 g的4周齡雌性SD大鼠骨髓間充質干細胞，利用體外細胞培養技術，將第3代BMSCs與HA-MWCNTs或未修飾的多壁碳納米管（MWCNTs）共培養，通過MTT法及活死細胞檢測評估碳納米管對BMSCs的細胞毒性；通過誘導其脂向及骨向分化，評估碳納米管對BMSCs多向分化能力的影響。 結果 與對照組比較，Raw-MWCNTs對細胞增殖有明顯抑制作用（P < 0.05），而HA-MWCNTs對細胞增殖活力影響較小（P > 0.05）；活死細胞檢測提示HA-MWCNTs組死細胞率較低。HA-MWCNTs使 BMSCs骨向分化相關基因Cbfal/Runx2、BSP、OCN的信使RNA升高（P < 0.05），脂向分化相關基因aP2、脂蛋白脂酶的信使RNA降低（P < 0.05）。 結論 與MWCNTs比較，HA-MWCNTs對細胞的增殖影響較小，細胞毒性較低，生物相容性良好。HA-MWCNTs可促進BMSCs骨向分化，抑制其脂向分化。其在骨組織工程領域中的應用具有良好前景。

[關鍵詞] 羥基磷灰石；碳納米管；骨髓間充質干細胞；多向分化

[中圖分類號] R318.08 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（c）-0004-06

[Abstract] Objective To develop hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes （HA-MWCNTs）， and assess the toxicity of HA-MWCNTs on rat′s BMSCs and its influence on the multipotent differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells （BMSCs）， thereby to provide experimental evidence for its utility in tissue engineering. Methods HA-MWCNTs were synthesized. Transmission electron microscope （TEM）， X-ray diffraction （XRD） were used to observe the microstructure； BMSCs were obtained from female SD rats of 4 weeks old which weighted between 100 to 150 grams. After cultured and expanded to the third passage， cells were co-cultured with HA-MWCNTs and unfunctionalized MWCNTs （MWCNTs）. MTT and live-dead cell assay were used to appraise the toxicity of MWCNTs on BMSCs. BMSCs were then induced and differentiated into adipocytic and osteoblastic cells and were used to assess the influence of MWCNTs on BMSCs′ multipotent differentiation. Results Compared to control group， BMSCs in MWCNTs group were significantly inhibited （P < 0.05）， while in HA-MWCNTs group， BMSCs were slightly inhibited， with no statistical difference （P > 0.05）， and the ratio of dead cells was less in HA-MWCNTs group. The mRNA level of osteogenesis （Cbfal/Runx2， BSP and OCN） was increased （P < 0.05） and the mRNA of adipogenesis （aP2 and LPL） was decreased （P < 0.05） in HA-MWCNTs group. Conclusion Compared with MWCNTs， HA-MWCNTs had slight influence on cell proliferation， trivial toxicity and favorable biocompatibility of BMSCs， meanwhile it could promote osteoblastic and inhibit adipocytic differentiation of BMSCs. HA-MWCNTs may supply a novel platform for applications of scaffold in bone tissue engineering.

[Key words] Hydroxyapatite； Carbon nanotube； Bone-marrow derived mesenchymal stem cell； Multipotent differentiation

腫瘤、創傷、先天性疾病導致的大范圍骨缺損是臨床上面臨的重大難題。骨缺損修復的方法有自體骨移植、異體骨移植、生物材料移植等方案[1]。自體骨作為骨缺損修復的金標準，具有生物相容性好、力學強度適宜等優點；然而，取材有限和供區的繼發畸形極大地限制了其臨床應用[2]。異體骨移植具有排異反應和感染疾病的風險，在臨床中應用較少[3]。利用具有優良骨傳導性的生物材料修復骨缺損，是目前國內外研究的熱點。

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是一種生物相容性較高的生物材料，具有優良的骨傳導性[4-5]。大量實驗已證實：將HA材料與骨髓間質充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）復合，是修復骨缺損的理想治療方法[6]。然而，HA韌性低、強度差的特點，限制了其在骨組織領域的應用[4]。為改善上述缺點，有學者將HA與碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）結合應用于骨組織工程研究中，并發現復合材料的強度及骨誘導性大大增強[7]。CNTs是一種具有獨特的物理、化學和生物學性能的納米材料，不僅具有強度高、韌性佳的優點，同時又具有良好的光學、磁學及電學性能[8]。它不僅可以將藥物靶向傳遞至特定組織，而且在紅外線照射下，能夠產熱殺滅病變細胞，為癌癥治療提供契機[9]。然而，在范德華力的作用下，CNTs極易在水或者有機溶劑中聚集成束。大量的實驗證明CNTs具有較大的生物毒性，能夠對組織和器官造成嚴重的破壞[10-11]。研究表明，HA-MWCNTs可以避免單一材料的缺點，起到增加復合材料強度及生物相容性的作用[12-14]。然而目前尚缺少HA-MWCNTs對細胞的毒性作用及多向分化潛能的相關研究。

為此，本實驗擬探索羥基磷灰石修飾的多壁碳納米管（hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes，HA-MWCNTs）對BMSCs的毒性作用及多向分化能力的影響，為HA-MWCNTs在骨組織工程領域的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

4周齡的雌性SD大鼠6只（100～150 g），許可證號：SYXK（川）2013-119，動物合格證號：01-3001，購自四川大學實驗動物中心。動物等級二級，預飼養2周。

1.2 藥品與試劑

多壁碳納米管（MWCNTs）：外徑10～20 nm，長度10～20 μm，純度≥95%（成都有機化學有限公司，中國科學院）；HA（成都科隆化學試劑有限公司）；活死細胞試劑盒、MTT、a-MEM培養基（GIBCO公司，美國）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司）；油紅O（成都寶信生物試劑有限公司）。

1.3 儀器與設備

X線衍射儀（XRD，Rigaku D/MAX2VA荷蘭）；透視電鏡（H-800，日本）；熒光倒置顯微鏡（尼康，日本）；ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems company，美國）；水平電泳儀（BL29-DYCP-31DN，中國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 HA-MWCNTs制備 利用原位化學沉淀法合成HA-MWCNTs。將氧化處理的MWCNTs加入SDS溶液中超聲分散2 h；加入到含有Ca（NO3）2·4H2O的生物礦化液中，調節pH值至10，超聲分散30 min；按照Ca、P的摩爾比為1.667，配置（NH4）2HPO4溶液，調節pH值至10，在劇烈攪拌下逐滴加入上述混合溶液中；將獲得的樣品靜置陳化2 d；用蒸餾水反復沖洗至濾液pH為7。利用透射電鏡檢測HA在MWCNTs表面的形成。用XRD測定HA-MWCNTs的各相成分。

1.4.2 細胞分離和培養 4周齡的雌性SD大鼠，斷頸處死，70%乙醇消毒30 min，取脛骨和股骨，去除骨上附著的軟組織和骨骺端。將分離的股骨和脛骨移入無菌平皿，用針管抽5 mL PBS將骨髓沖出，用200目濾網過濾，1500 r/min 25℃ 離心4 min（離心半徑9 cm）。將沉淀的細胞重懸于10 mL培養基中，2×106個細胞接種于90 mm培養皿中。接種后24～48 h換液，7～10 d傳代。培養至第三代的BMSCs備用。

1.5 測量指標

1.5.1 MTT 將MWCNTs、HA-MWCNTs溶于a-MEM培養基中，配成10 μg/mL混合培養基。將第三代的BMSCs以每孔103～104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL。放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下進行培養。分別于1、3、5 d對細胞活力進行評估。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，終止培養，棄上清液。每孔加入150 μL二甲基亞楓，震蕩10 min后于490 nm波長測吸光度。

1.5.2 活死細胞檢測 將BMSCs與MWCNTs、HA-MWCNTs共培養72 h；運用活死細胞試劑盒對細胞進行染色，活細胞呈現綠色熒光，死細胞呈現紅色熒光。

1.5.3 BMSCs的成骨和成脂誘導 以5×106的細胞量接種于6孔板；培養基為含或不含30 μg/mL HA-MWCNTs的成骨或者成脂誘導培養基；2周后，行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測及染色，茜素紅染色，油紅O染色，實時定量多聚酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質印跡檢測。

1.5.4 RT-PCR 使用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板在ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀上進行擴增；成骨向分化的目的基因為核心結合因子（Cbfa1/Runx2）、骨涎蛋白（BSP）和骨鈣素（OCN），成脂向分化的目的基因為過氧化物酶體增生物激活受體γ2（PPARγ2）、脂肪酸結合蛋白2（aP2/ALBP）和脂蛋白酯酶（LPL），β-actin作為內參。目的基因的引物設計序列見表1。

1.5.5 蛋白質印跡分析 首先利用SDS-PAGE凝膠電泳技術分離提取蛋白質，并將其轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；將膜置入含3% BSA的0.05% TBS-Tween 20封閉液中（室溫，2 h），然后根據試劑盒說明加入適量的一抗（抗Cbfal/Runx2、PPARγ和GAPDH）室溫孵育2 h；用0.05% TBS-Tween 20洗滌PVDF膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h；化學發光法顯示目的條帶，定量分析光密度值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，單因素的方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HA-WMCNTs官能團檢測

透射電鏡顯示：HA晶體均勻的纏繞于MWCNTs表面，呈球狀，而非短棒狀結構，這表明MWCNTs作為結晶中心，為HA在納米管表面的生長提供支持，見圖1。XRD顯示：在HA功能化的MWCNTs中，有羥基磷灰石組分的形成。HA組分的特異性峰值主要集中在25.9°、31.8°、39.7°，見圖2。

2.2 HA-MWCNTs的細胞毒性

MTT提示，與對照組比較，HA-MWCNTs和MWCNTs能夠抑制細胞的增殖，但HA-MWCNTs則對細胞的增殖活力沒有大的影響，表現出良好的生物相容性，見圖3。活死細胞檢測示，活細胞呈現綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。MWCNTs組的死細胞比率較大，而HA-MWCNTs組死細胞較少，見圖4（封底）。

2.3 HA-MWCNTs對BMSCs分化的影響

成骨：與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組的ALP顆粒的陽性分布率較高，ALP活性較高。見圖5～6。

成脂：HA-MWCNTs組油紅O洗脫液的吸光度在第2周降低了27.9%（P < 0.05），與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組觀察到較少的脂滴形成。見圖7。

RT-PCR：檢測結果用mRNA表達的相對倍數表示，結果顯示，成骨或成脂誘導培養2周后，HA-MWCNTs組與MWCNTs組比較，Cbfal/Runx2增加了36%（P < 0.05），BSP增加了74%（P < 0.05），OCN增加了97%（P < 0.05）；而PPARγ2下調了26%（P < 0.05），aP2/ALBP下調了42%（P < 0.05），LPL下調了49%（P < 0.05），提示HA-MWCNTs組成骨相關基因（Cbfal/Runx2、BSP、OCN）的表達增加，成脂相關基因（PPARγ2、aP2/ALBP、LPL）的表達降低。見圖8。

蛋白質印跡：成骨或者成脂誘導2周后，與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組細胞中Cbfal/Runx2的蛋白表達水平增加78%（P < 0.05）；而PPARγ的蛋白水平下調31%（P < 0.05）。見圖9。

3 討論

HA是一種具有高度生物活性的硬組織植入材料，在骨科領域被廣泛應用，但是存在強度低、韌性差的缺點[4]。CNTs具強度高，韌性好，并且具有優異的光、電、磁學性能，在生物力學領域具有較好的前景。將CNTs和HA復合能夠增強復合物的生物力學性能，同時提高其生物相容性[6，15]。研究表明，MWCNTs的加入不僅改變了HA的物理形貌，而且也增強了磷酸鈣水泥的機械強度，抗壓強度達到了16.3 MPa，超過了人體松質骨的強度。目前已有較多研究報道了HA-MWCNTs的制備，及其物理、化學、生物學性能[4，7，15-18]。

Jing等[16]發現膠原/HA/MWCNTs復合物在體內外均表現出優良的骨誘導性及骨傳導性。Li等[7]發現HA-MWCNTs復合物具有較強的力學強度及粗糙的微觀結構，有利于骨缺損創面中成骨細胞的黏附及生長，促進成骨細胞的活性，從而增強骨再生。此外，Li等[7]的實驗報道了碳納米管不僅能夠促進脂肪間充質干細胞的骨向分化，而且在體內能夠誘導異位骨的形成。這些實驗結果為碳納米管在組織工程領域的應用提供了實驗依據。

本實驗研究了HA-MWCNTs對大鼠BMSCs的毒性作用及多向分化的影響。結果表明：羥基磷灰石功能化的碳納米管溶解性高，細胞毒性較小。已有文獻報道：羥基磷灰石能夠促進BMSCs的增殖和骨向分化。本實驗結果顯示：BMSCs在成骨或者成脂誘導2周后，HA-MWCNTs增加了細胞Cbfal/Runx2、BSP、OCN成骨相關因子的表達，而抑制了成脂相關基因PPARγ2、aP2/ALBP的表達。此結果與前期文獻報道的細胞的成骨和成脂相關基因是反向調節的結論一致[19-21]。

本實驗的缺陷：①只使用一種HA-MWCNTs的濃度（30 μg/mL），尚無法反映HA-MWCNTs與BMSCs增殖、分化的量效關系；②只使用一個時間點（2周），數據尚不足以評估HA-MWCNTs與BMSCs多向分化的時間-效應關系。故而，多劑量、多時間點的實驗有待于進一步實施。

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（收稿日期：2018-02-25 本文編輯：任 念）