骨橋蛋白、淋巴細胞活化基因-3、Dickkopf相關蛋白1在胃癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性

顧磊，肖婕，文斐

[鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)病理科，黃石 435000]

胃癌是臨床上比較常見的一種惡性腫瘤，患者的死亡率以及發病率都位居消化系統腫瘤的首位。當前情況下，胃癌患者的具體作用機制仍然不夠明確。不過胃癌轉移侵襲是患者預后較差的風險因素[1]。腫瘤標志物作為腫瘤細胞惡化過程當中表達癌基因生成的活性物質，在患者血液、體液以及腫瘤組織當中都可以檢出，良性組織或者是正常組織當中不表達或者是低表達，所以醫務人員可以通過檢測腫瘤標志物表達來判斷患者病情[2]。本研究通過檢驗骨橋蛋白(OPN)、淋巴細胞活化基因-3(sLAG-3)、Dickkopf相關蛋白1(DKK-1)在胃癌組織當中的表達，分析其同患者病理特征之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月至2017年2月我院收治的胃癌患者160例，其中男101例，女59例；年齡范圍22～69歲，年齡(35.4±2.6)歲；病程范圍2～13年，病程(8.1±0.4)年。

1.2 納入與排除標準 納入標準：患者經過病理學檢查確診屬于胃癌；年齡超過18歲；經過CT或者超聲胃鏡檢查進行TNM分期；均進行切除手術治療。排除標準：患者存在惡性腫瘤病史；合并其他腫瘤；曾進行免疫治療或者放化療；合并嚴重肝腎功能障礙；合并凝血功能障礙；妊娠哺乳期女性。患者均知情同意本研究，并且本研究通過醫院倫理委員會審核。

1.3 方法

1.3.1 標本來源 患者手術過程當中切取胃癌組織以及正常胃黏膜組織(距離患者的腫瘤邊緣要超過5cm)。切取之后放入液氮并且使用冰箱進行冷凍保存。

1.3.2 OPN檢測 主要試劑為鼠抗人OPN抗體以及SP免疫試劑盒(北京金橋生物公司生產)。具體檢測步驟方面，應用免疫組織化學法進行，標本使用10%的甲醛進行固定，石蠟包埋固定之后，3 μm切片。染色步驟根據免疫試劑盒的說明書嚴格進行操作，應用PBS替代一抗進行陰性對照，用已經證實的OPN染色陽性切片當作陽性對照[3]。

1.3.3 sLAG-3檢測 sLAG-3表達的檢測方面應用固相夾心酶聯免疫法(ELISA法)進行，具體操作步驟嚴格根據試劑盒的說明書進行操作。首先將標準品依次進行倍比稀釋，相應的試劑根據說明依次進行稀釋。加樣過程當中分別設置空白孔、標準孔以及待檢測的樣品孔，其中樣品孔設置為復孔。確定之后依次添加不同濃度50 μL的標準品以及稀釋之后的樣品，在常溫條件下持續孵育60 min。之后棄去液體并且依次添加50 μL的檢測溶液A，在常溫條件下持續孵育60 min之后洗板。甩盡板內液體的液體之后使用洗滌液反復沖洗反應板，在厚吸水紙上面反復拍干，之后，洗滌2次并且添加50 μL檢測溶液B，持續孵育60 min。反復洗板3次之后每孔添加30 μL的底物溶液，在室溫條件下避光顯色20 min。之后每孔添加30 μL的終止液，震蕩混勻確保顏色從藍色逐漸轉變為黃色。使用酶標儀在350 nm的波長檢測各孔吸光度(OD值)。將標準品當中的OD值當作橫坐標，標準品的濃度當作縱坐標，從而繪制標準曲線，應用標準曲線法來判斷樣品濃度[4]。

1.3.4 DKK-1檢測 檢測使用的試劑為兔抗人GSK-3β抗體(上海斯信科技公司生產)，兔抗人DKK-1抗體為(上海由誼忠聯公司生產)，兔抗人β-catenin抗體、SP免疫試劑盒及DAB顯色劑(北京金橋生物公司生產)，光學顯微鏡以及DP70圖像采集系統為日本奧林巴斯公司生產。具體檢測步驟方面，取患者的石蠟包埋標本，連續制成3 μm的切片，常規脫蠟之后使用微波進行抗原的修復，使用3%的過氧化氫溶液從而阻斷標本當中存在的過氧化物酶活性。應用正常山羊血清進行封閉，為各個標本分別滴加一抗兔抗人兔抗人GSK-3β抗體、兔抗人DKK-1抗體以及兔抗人β-catenin抗體，常溫條件下持續孵育62 min之后依次添加山羊抗兔二抗，并且應用辣根酶來標記蛋白素。DAB進行顯色之后應用蘇木精完成復染，之后分別進行脫水、透明以及封固處理。上述實驗步驟當中，PBS替代一抗當作陰性對照，使用陽性切片當作陽性對照。

1.4 觀察指標 染色程度評分方面：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。細胞比例評分方面，0分為陽性細胞的占比低于10%，1分是陽性細胞的占比在10%～25%之間，2分是陽性細胞的占比在25%～50%之間，3分是陽性細胞的占比超過50%。將染色評分以及比例評分相加得到綜合評分，其中<2分為陰性(-)，2～3分為疑似陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6分為強陽性(+++)，后兩者判斷屬于陽性表達[5]。

對比患者胃癌組織、癌旁組織以及正常胃黏膜組織當中OPN、sLAG-3、DKK-1表達情況，同時分析三者同患者年齡、性別、分化程度、浸潤深度、TNM分期以及淋巴結轉移與否等病理特征的關系[6]。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0分析數據，觀測數據均為計數資料。常規計數資料比較應用χ2檢驗，等級計數資料比較應用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織當中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達陽性對比 胃癌組織當中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達陽性率顯著高于癌旁組織以及正常胃黏膜組織(P<0.05),見表1。

表1 不同組織當中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達陽性對比(例)

注：OPN為骨橋蛋白，sLAG-3為淋巴細胞活化基因-3，DKK-1為Dickkopf相關蛋白1，下表同；兩兩比較為分割卡方檢驗，與癌旁組織比較，aP<0.05;與正常胃黏膜組織比較，bP<0.05

2.2 OPN蛋白在胃癌組織當中的表達 OPN蛋白在胃癌組織當中的表達同分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及胃癌分期等有顯著關聯關系(P<0.05)，見表2。

表2 OPN蛋白在胃癌組織當中的表達(例)

注：秩和檢驗

2.3 sLAG-3蛋白在胃癌組織當中的表達 sLAG-3在胃癌組織當中的表達同患者的胃癌分期、浸潤深度以及分化程度等有顯著的關聯關系(P<0.05)，見表3。

表3 sLAG-3蛋白在胃癌組織當中的表達(例)

注：秩和檢驗

2.4 DKK-1蛋白在胃癌組織當中的表達 DKK-1蛋白在胃癌組織當中的表達同分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著的關聯關系(P<0.05)，見表4。

表4 DKK-1蛋白在胃癌組織當中的表達(例)

注：秩和檢驗

3 討論

胃癌是我國比較常見的一種惡性腫瘤，轉移以及侵襲是影響患者預后的關鍵因素。相關研究的結果表明，一半以上的胃癌患者在藥物治療以及手術治療之后，仍然死于腫瘤轉移或者是復發問題[7]。近年來分子生物學技術持續進步，為胃癌轉移以及侵襲的分子學研究提供了基礎，研究人員在此基礎上探索同胃癌轉移存在聯系的分子標志物，從而及時預測并且綜合評估患者的預后，為臨床治療提供可靠指導。本研究結果顯示，胃癌組織OPN、sLAG-3以及DKK-1表達陽性率顯著高于癌旁組織以及正常胃黏膜組織(P<0.05)。OPN富含唾液酸，最早發現于骨基質當中，后續在人體的腎臟、消化道以及胎盤當中發現。因為OPN能在骨基質以及細胞之間發揮橋梁作用，所以被成為骨橋蛋白[8]。OPN蛋白屬于細胞因子的一種，同時又是非膠原成分，含有同細胞黏附存在聯系的RGD(精氨酸-天冬氨酸)序列，并且可以借助于同受體以及整合素的結合刺激信號，誘導細胞遷移以及增殖，參與到炎性反應以及組織修復等過程[9]。臨床檢驗結果顯示OPN在肺癌以及卵巢癌等腫瘤當中的表達顯著上升，并且可以同受體結合來刺激腫瘤細胞的分化、增殖或者是浸潤。在人體的消化系統當中，OPN主要存在于黏液細胞以及上皮細胞當中，并且同胃癌發生以及發展存在密切聯系。本研究結果顯示，OPN蛋白在胃癌組織當中的表達同分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著相關性(P<0.05)。有研究人員對比胃癌患者以及健康人員的OPN含量，胃癌患者血清當中的OPN水平明顯高于健康人群，同時集中在50～100 μg/L，這提示OPN高含量同胃癌發生有顯著正相關[10]。

sLAG-3屬于免疫球蛋白，能夠發揮免疫調節作用。研究結果顯示，在ADAMl0等蛋白酶類的影響下，LAG3的細胞膜表面跨膜區域肽鏈會出現斷裂，胞外位置脫落并且轉化成為可溶性的LAG-3也就是sLAG-3。sLAG-3可以同細胞分子互相作用，強化樹突狀細胞，并且在此基礎上激活CD4+以及CD8+細胞，達到抑制腫瘤細胞的效果[11]。本研究結果發現，sLAG-3在胃癌組織當中的表達同患者的胃癌分期、浸潤深度以及分化程度等存在顯著相關性(P<0.05)。胃癌患者sLAG-3的整體含量明顯低于對照組，并且推測其含量的下降會影響到T細胞的激活，加大了癌細胞免疫逃逸，使得胃癌患者的病情惡化。

DKK-1屬于分泌蛋白家族，可以同Wnt-蛋白復合結合，從而影響到后者形成三聚體復合物，進一步抑制Wnt信號通路。研究人員發現DKK1對于Wnt信號通路的影響同惡性腫瘤病情的發生發展存在聯系，并且能夠刺激癌細胞的侵襲以及增殖[12]。本研究結果顯示，DKK-1蛋白在胃癌組織當中的表達同分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著相關性(P<0.05)。研究人員分析胃癌患者的DKK-1表達，結果顯示其表達水平要明顯高于健康人群。這提示DKK-1的高表達能夠刺激胃癌的發生。綜合以上分析可以發現，胃癌患者組織當中的OPN水平以及DKK-1水平明顯上升，同時sLAG-3水平明顯下降，提示三者可以用來診斷患者并且評估患者病情的嚴重程度。

病理檢查是胃癌患者臨床診斷的金標準，常用的指標包括分化程度以及TNM分期等。通過分析不同分化程度以及不同TNM分期患者胃癌組織當中的OPN、sLAG-3以及DKK-1水平，結果表明I期、Ⅱ期患者以及高中分化患者的OPN、DKK-1水平明顯低于Ⅲ期、Ⅳ期患者以及低未分化患者，同時sLAG-3水平明顯高于Ⅲ期、Ⅳ期患者以及低未分化患者。這就表明三項指標可以用來評估患者分化程度以及分期狀況。細胞凋亡可以說是程序性死亡的正常步驟，也是人體實現異質細胞清除的作用途徑。胃癌病情惡化的過程當中，OPN、sLAG-3以及DKK-1水平出現波動，會影響到細胞凋亡的過程，從而給病情發展創造條件，需要引起醫務人員的重視，在治療過程當中動態監測三者表達的變化，在此基礎上合理調整治療方案。

綜上所述，OPN、sLAG-3、DKK-1表達與胃癌分期、浸潤深度以及淋巴結轉移等因素存在密切聯系，能夠評估患者的病情及預后質量。