牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

李昱瑩，郭麗麗，廉小芳，郭大龍，侯小改*

(河南科技大學(xué) a農(nóng)學(xué)院，b林學(xué)院，河南 洛陽 471000)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)屬芍藥科芍藥屬，多年生落葉亞灌木，是我國特有的植物[1]，主要分布于我國中部、西南部至西北部[2-3]。自古以來，牡丹象征著國家繁榮興盛，民族幸福吉祥。具有很高的觀賞、食用，以及藥用價值。國家衛(wèi)生部監(jiān)督局于2011年3月指出可將油用牡丹鳳丹和紫斑作為新型木本糧油植物資源進(jìn)行開發(fā)和利用[4]。牡丹籽油已逐步發(fā)展成我國重要的食用油，與其他油料作物相比，具有高產(chǎn)出(667 m2綜合效益達(dá)萬元)、高含油率(籽含油率≥22%)、高品質(zhì)(不飽和脂肪酸含量高于90%，α-亞麻酸高達(dá)42.8%，脂肪酸比例均衡)、低成本(耐旱耐寒耐貧瘠)等特點(diǎn)。因此，大力推廣油用牡丹的種植對促進(jìn)我國糧油生產(chǎn)、改變食用油消費(fèi)結(jié)構(gòu)以及保障國家糧油安全均具有重要意義，其發(fā)展前景非常廣闊。

牡丹的有性繁殖為種子繁殖，但播種后代存在分離變異，不能較好地保存母本優(yōu)良性狀[5]，且其種子存在生理后熟和二次休眠現(xiàn)象，導(dǎo)致播種育苗周期較長[6]；其無性繁殖主要是分株、扦插、壓條、嫁接等[7]，但存在繁殖系數(shù)低、成苗周期長、出苗量少且質(zhì)量參差不齊等問題。與傳統(tǒng)育苗技術(shù)相比，組織培養(yǎng)技術(shù)有利于牡丹育種和快速繁殖[8]。因此，通過組織培養(yǎng)技術(shù)解決牡丹常規(guī)繁殖過程中存在的問題，將是油用牡丹發(fā)展走向商品化和產(chǎn)業(yè)化的必然趨勢[9]，也是加速其繁殖和育種的有效措施。

牡丹組織培養(yǎng)可在較短時期內(nèi)擴(kuò)繁大量優(yōu)良品種，并能利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在短期內(nèi)培育牡丹新品種[10]，可以在一定程度上打破傳統(tǒng)育種技術(shù)固有的局限性。時至今日，關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)的研究主要集中在愈傷組織誘導(dǎo)、適宜生長調(diào)節(jié)劑配比、外植體選擇以及培養(yǎng)基完善等方面，但是牡丹快速繁殖(即微繁殖)體系尚未被確定，因此仍然無法滿足牡丹新品種培育和優(yōu)良品種推廣栽培的要求。此外，組織培養(yǎng)過程中仍存在污染嚴(yán)重、繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)褐化以及玻璃化現(xiàn)象、生根困難、移栽成活率低等問題亟待解決[11]。本文從外植體選擇及分化途徑，影響增殖和生根的主要因素等幾個方面概述了近年來牡丹組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，同時論述了組織培養(yǎng)過程中污染、褐化以及玻璃化等問題出現(xiàn)的原因及其可能的解決方法，以期為今后開展牡丹組織培養(yǎng)新技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 牡丹再生體系研究

1.1 外植體的選擇及分化途徑

外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)過程中最重要的一步，近年關(guān)于牡丹的組織培養(yǎng)方面，國內(nèi)外研究學(xué)者均有大量報(bào)道[12]。可供選擇的外植體種類繁多，其中主要有芽、莖尖和莖段、胚和胚珠、葉片和葉柄、花藥和花絲等，但不同外植體具有不同的分化能力，同一外植體的采摘時間和處理方式不同，其誘導(dǎo)的結(jié)果也不同。另外，不同的發(fā)生途徑對外植體也有一定要求，因此將外植體選擇與發(fā)生途徑結(jié)合起來，才能建立正確有效的組培體系。

1.1.1 外植體的選擇

牡丹組織培養(yǎng)的研究開始于1965年。隨后Bouza等[13]發(fā)現(xiàn)了選擇牡丹葉和腋芽組培最有效的細(xì)胞分裂素，從而推動了國內(nèi)外對于全方位了解牡丹組培的高潮。在國內(nèi)，李玉龍等[14]最早開展了牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，其主要研究青龍臥墨池和十八號兩個品種不同外植體的誘導(dǎo)情況。現(xiàn)階段關(guān)于建立牡丹無菌體系的研究大都集中在外植體類型、取材時間、品種以及消毒方式4個方面。

外植體類型。自從德國植物生理學(xué)家和植物學(xué)家Haberlandt提出了植物細(xì)胞全能性的概念之后，組織培養(yǎng)作為一種高效的植物快繁技術(shù)顯示出了巨大的應(yīng)用價值，即任何外植體都具備在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)生成完整植株的能力。但研究表明，同一植株的不同外植體在器官發(fā)生能力上呈現(xiàn)出較大的差異。有研究表明，在牡丹組織培養(yǎng)過程中，土芽和幼芽的誘導(dǎo)率最高，葉片、葉柄次之，心皮和雄蕊卻未能誘導(dǎo)成功[15]。

外植體取材時間。關(guān)于牡丹芽取樣時間的研究表明，2月份獲取的外植體進(jìn)行培養(yǎng)時，污染率低，萌發(fā)時間早，植株健壯，培養(yǎng)效果最好；相反，8—10月的外植體在誘導(dǎo)時不僅極易污染，而且萌芽緩慢，后期葉片發(fā)黃且生長瘦弱，容易出現(xiàn)褐化死亡等現(xiàn)象[16-17]。這是因?yàn)榇藭r的外植體尚未經(jīng)歷休眠，芽體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)少；且對2月份取材而言，冬季的自然低溫可將土壤及植株上已附著的病菌、細(xì)菌等微生物凍死，從而減少了外源污染；另外，冬季自然低溫致使植株及芽內(nèi)的激素含量產(chǎn)生動態(tài)變化，例如IAA、GA3等促進(jìn)萌發(fā)和生長的激素類含量增加，ABA等抑制萌發(fā)和生長的激素類含量減少[18]，從而改善了芽外植體的培養(yǎng)效果。

關(guān)于不同時期的花藥誘導(dǎo)愈傷組織的研究結(jié)果表明，不同時期的花藥誘導(dǎo)率也不盡相同，單核中期花藥誘導(dǎo)率最高，其次是單核晚期，而單核早期和雙核期均明顯低于單核晚期[19]。可能的原因是當(dāng)花藥發(fā)育到四分體時期時，還沒有發(fā)育完全，此時并不適合用來誘導(dǎo)愈傷組織。當(dāng)達(dá)到單核中期時，細(xì)胞的生命活力最強(qiáng)，供給的營養(yǎng)也較為充沛，且細(xì)胞馬上開始有絲分裂，因此對誘導(dǎo)條件最為敏感，此時的花藥細(xì)胞極易發(fā)生染色體軸向的改變[20]，從而進(jìn)入脫分化分裂，導(dǎo)致單核中期花藥最易產(chǎn)生愈傷組織。

外植體品種。研究發(fā)現(xiàn)，不同觀賞品種的牡丹，其誘導(dǎo)結(jié)果會存在一定的差異。當(dāng)以豆綠、黑花魁、大胡紅和金星雪浪為材料進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)時[16]，前兩者增殖系數(shù)較高、誘導(dǎo)分化出的叢生芽數(shù)量較多，而后兩者的增殖系數(shù)卻相對較低。各個品種之間誘導(dǎo)差異顯著，一些品種極易體外培養(yǎng)成活，一些品種出現(xiàn)褐化、玻璃化現(xiàn)象而使成活率降低，還有一些品種表現(xiàn)出體外發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，并且這種基因依賴現(xiàn)象還會影響到后期的繼代培養(yǎng)表現(xiàn)[21]。由此可見，基因型的差異對牡丹組織培養(yǎng)的影響也較大。

消毒方式。外植體的消毒滅菌是組培技術(shù)中最重要的環(huán)節(jié)之一，不同品種、不同類型的外植體，其最適消毒方法均不同。常用的消毒劑有0.1%～0.2% HgCl2[22]、70%～75%無水乙醇[11]、次氯酸鹽[23]等。一般的滅菌程序均為先對新鮮采集的外植體進(jìn)行表面基本滅菌，然后利用合適的消毒劑消毒，最后用無菌水沖洗殘留消毒劑。有的外植體消毒困難，會有二次或多次滅菌[17]。

唐豆豆等[22]研究表明，使用0.1% HgCl2對鳳丹根蘗芽與鱗芽消毒8 min時，效果最好；而消毒過程持續(xù)超過10 min時，消毒劑對外植體本身的傷害較大，導(dǎo)致后期苗成活率較低。另外有研究表明，最好的消毒方式是直接使用升汞消毒[24]，但也有人認(rèn)為無水乙醇與升汞交替使用效果最佳[25]。對牡丹而言效果最好的消毒方式是75%無水乙醇浸泡40～50 s，無菌水清洗后用0.2%升汞消毒 6～8 min[26-27]。不過也有研究表明，使用生物殺菌劑處理牡丹鱗芽時能達(dá)到100%消毒，且對材料無傷害，優(yōu)于使用HgCl2消毒[28]。此外消毒方式可以間接影響組培苗的褐化現(xiàn)象，研究顯示，與使用升汞消毒相比，使用NaClO會導(dǎo)致外植體的褐化程度加深[23]。

1.1.2 腋芽萌發(fā)途徑

大多數(shù)進(jìn)行組培快繁的植物，其外植體器官發(fā)生途徑均為腋芽萌發(fā)途徑，這種途徑是不經(jīng)過脫分化產(chǎn)生愈傷組織后再生，而是直接由其分生中心分化出植物器官，最終成長為完整的植株。腋芽萌發(fā)途徑能很好地保留母本的優(yōu)良性狀，雖然變異率小，但增殖率通常較低且繁殖系數(shù)不高。由腋芽萌發(fā)途徑建立的組培體系中，外植體部位和外植體的預(yù)處理是影響培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。牡丹組培常用的芽有頂芽[29-30]、腋芽[31]、萌蘗芽[32-33]。大部分的研究認(rèn)為，不同部位的芽的誘導(dǎo)率有明顯的差別，其中萌蘗芽[32]誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，花芽分化能力最低，可能是萌蘗芽組織分化程度較低，導(dǎo)致其誘導(dǎo)增殖能力最強(qiáng)。另外低溫預(yù)處理離體芽尖[33]后，其萌發(fā)率及發(fā)育速率會再次提高，且低溫處理之后外植體污染率及褐化率明顯降低。

1.1.3 間接器官發(fā)生途徑

植物的間接器官發(fā)生途徑是指外植體在一定條件下經(jīng)過脫分化誘導(dǎo)后產(chǎn)生愈傷組織，而后再由愈傷組織分化出不定芽或不定根，從而形成完整植株。由于脫分化所形成的愈傷組織可在較短時間內(nèi)重新誘導(dǎo)分化出大量新生植株，因此，通過誘導(dǎo)愈傷組織，可使外植體的繁殖系數(shù)大量增加，完成快速擴(kuò)繁。但愈傷組織細(xì)胞團(tuán)的遺傳性質(zhì)是不穩(wěn)定的，而且隨著繼代時間的增長，它們的分化再生能力會逐漸下降，甚至完全消失。近年來關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)的研究也有以此途徑誘導(dǎo)再生植株的案例，在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，外植體類型、培養(yǎng)基種類、激素配比和培養(yǎng)條件均對培養(yǎng)結(jié)果有不同程度的影響。目前，牡丹組培中愈傷組織誘導(dǎo)常用的外植體有莖尖和莖段[34-38]、葉片和葉柄[39-41]、花藥和花絲[42-43]、種胚[44-45]、根韌皮部[46]等。研究表明，牡丹不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織存在高度異質(zhì)性[47]。

近年來，以牡丹莖尖為材料進(jìn)行的組織培養(yǎng)也取得了一些進(jìn)展。李志軍等[34]用大胡紅莖尖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，30 d后每小段的簇生芽可達(dá)4～6個，說明其莖尖分化能力較強(qiáng)。隨后，在不同牡丹品種莖尖和莖段[10，35]誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明，莖尖分化能力較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，適合愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1BA+0.01 mg·L-1NAA。另外，研究學(xué)者也進(jìn)行了大量的不同品種牡丹莖段誘導(dǎo)愈傷的研究實(shí)驗(yàn)[36-37]，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。朱向濤[38]用江南牡丹莖段誘導(dǎo)愈傷組織時發(fā)現(xiàn)在愈傷組織分化過程中，加入0.2 mg·L-1KT效果最好，除此之外有機(jī)物的增加也有助于促進(jìn)愈傷組織分化，其中以加入300 mg·L-1水解酪蛋白效果為最佳。

葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要營養(yǎng)器官，而葉柄是莖段培養(yǎng)的重要材料，二者作為外植體可加速良種植物的保存，解決不能用種子繁殖或難以用種子保存的種質(zhì)資源保存[48]。安佰義[39]用無葉柄幼葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，研究MS，B5和WPM 3類培養(yǎng)基的適用性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基更適用于該外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。李麗霞等[40]以大胡紅和荷花紫的幼葉為外植體，用水解酪蛋白和4種植物生長調(diào)節(jié)劑(BA、2,4-D、KT、NAA)誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織對2,4-D最為敏感。張健欣[41]分別以紫斑牡丹的大田和無菌苗葉片、葉柄為材料，研究NAA在愈傷組織誘導(dǎo)中對其誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果表明，葉片和葉柄誘導(dǎo)愈傷組織時NAA的最佳濃度為0.3 mg·L-1和0.4 mg·L-1；另外不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率表現(xiàn)出明顯的差異，誘導(dǎo)愈傷的能力水平為無菌苗葉柄>大田葉柄>無菌苗葉片>大田葉片。

牡丹具有多核或多細(xì)胞花粉，說明其具有良好的誘導(dǎo)潛力，因此花粉誘導(dǎo)是獲得單倍體和純合體的有效途徑[49]。當(dāng)前，對于牡丹花藥和花粉培養(yǎng)仍停留在誘導(dǎo)出愈傷組織階段，并沒有誘導(dǎo)出完整植株，說明牡丹花藥和花粉培養(yǎng)還處于起步階段。朱向濤等[42]以鳳丹帶花絲的花藥為材料誘導(dǎo)愈傷組織時發(fā)現(xiàn)單核中期為其取材的最佳時期，在4 ℃低溫條件下對外植體進(jìn)行預(yù)處理后，其愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)50.8%。劉會超等[43]以烏龍捧盛花藥為外植體，研究不同培養(yǎng)基和激素組合對其愈傷組織誘導(dǎo)率的影響中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基為最佳，Miller培養(yǎng)基次之，B5培養(yǎng)基則較差，其誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+2 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-BA+0.5 g·L-1水解乳蛋白。

胚培養(yǎng)是指無菌條件下將植物的種胚接種在適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)育成苗的一種組織培養(yǎng)技術(shù)。該技術(shù)不僅可以減緩胚敗育和發(fā)育不良的情況，也可以縮短休眠期，加快種子發(fā)育、促進(jìn)萌發(fā)，另外胚的離體培養(yǎng)可將萌發(fā)時間縮短28～42 d[50-51]。Demoise等[52]利用牡丹種子成熟胚成功地誘導(dǎo)出愈傷組織，使更多研究人員開始重視對牡丹的胚培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期的胚誘導(dǎo)愈傷組織的情況也有差異，幼胚分化程度低，其誘導(dǎo)率比成熟胚高[44]。激素的選擇在一定程度上也有很大的影響，在添加2,4-D和TDZ的培養(yǎng)基上，日本品種太陽已成功地由胚誘導(dǎo)出愈傷組織[53]。另外，H2O2等外源物質(zhì)的使用對牡丹胚的誘導(dǎo)也有促進(jìn)作用[45]。

胚珠培養(yǎng)是指在無菌條件下培養(yǎng)子房中所取得的胚珠，使胚珠直接或通過誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽、珠心及其他器官獲得試管苗[50]。胚珠培養(yǎng)具有縮短發(fā)芽時間，提高萌發(fā)率，保存雜交胚胎和加快育種的能力。2006年何桂梅等[54]首次報(bào)道關(guān)于牡丹胚珠培養(yǎng)的研究，指出花后48 d的胚珠很難培養(yǎng)，可能是因?yàn)闆]有完成受精或在培養(yǎng)基中沒有足夠的營養(yǎng)物；花后60 d的胚珠(胚胎完全分化)在MS培養(yǎng)基中，可以發(fā)育成苗，但需要及時移除胚乳。

1.1.4 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑

體細(xì)胞胚發(fā)生途徑最早是在針葉樹種離體培養(yǎng)研究中獲得的，一些木本植物現(xiàn)已成功建立了通過此途徑獲得再生植株的體系。目前，能成功誘導(dǎo)出體胚的牡丹品種很少，且誘導(dǎo)率普遍較低[55-65]。對于油用牡丹品種鳳丹的研究也僅在殷麗青等[44]和周秀梅[57]的論文中有所提及，但所提出的研究結(jié)果均顯示體胚誘導(dǎo)率極低，且大多數(shù)體胚誘導(dǎo)成功之后因不能繼續(xù)生長，導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法開展。由此可見，牡丹的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)仍然較為困難。

BMD提供了支持定理1中對函數(shù)進(jìn)行A變換的算術(shù)運(yùn)算[12]，如A(xi∧xj)通過算術(shù)與實(shí)現(xiàn)，A(xi⊕xj)通過算術(shù)異或?qū)崿F(xiàn)，并且可以實(shí)現(xiàn)定義6中的“在A變換過程中利用冪等律抑制隨機(jī)變量的指數(shù)成分”.對函數(shù)f的邏輯表達(dá)式實(shí)施相應(yīng)的算術(shù)運(yùn)算即可得到A(f)對應(yīng)的BMD，將隨機(jī)變量Xi的值代入，進(jìn)行BMD求值[12]即可得到f的信號概率.BMD可以較高效率地表示和操縱類似于概率表達(dá)式的代數(shù)表達(dá)式，并且BMD求值的復(fù)雜度為線性復(fù)雜度[12]，因此本文在底層使用BMD表示概率表達(dá)式.

外植體的種類、基因型和前期預(yù)處理等均對體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有影響。王瑩等[58]把不同收獲期的紫斑種胚作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，種子成熟度不同對組培苗的生長有一定影響。大部分研究表明，牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生的最佳時期是花后90～110 d[59]。朱向濤等[60]用合子胚、胚軸和子葉作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，從而探究不同外植體的誘導(dǎo)情況，結(jié)果表明，種胚的誘導(dǎo)率最高。Brukhin等[61]研究發(fā)現(xiàn)，以球形胚階段后的胚狀體為外植體時，其繁殖能力最強(qiáng)；而心形胚和魚雷形胚只有25%能誘導(dǎo)成株；在誘導(dǎo)愈傷組織時，成熟種胚、魚雷形胚和心形胚的誘導(dǎo)率依次降低。另外，多數(shù)學(xué)者研究證明激素配比對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響也極為重要。

1.2 影響增殖的主要因素

1.2.1 培養(yǎng)基

由于牡丹基因型及外植體選擇的多樣性，其誘導(dǎo)過程中所選培養(yǎng)基種類也不盡相同。主要的基本培養(yǎng)基有B5[62]、LP[63]、N6、LM[64]、DCR[61]、MS[65-66]和WPM[67-68]培養(yǎng)基，牡丹組培中使用最普遍的培養(yǎng)基是MS及各種改良的MS培養(yǎng)基，也有用WPM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)基內(nèi)所含無機(jī)鹽、有機(jī)營養(yǎng)物以及外植體生長所需的碳源和氮源有所不同，其種類和成分直接影響到組培苗的生長[69]。

初代培養(yǎng)指外植體接種后最初的幾代培養(yǎng)，其目的是為了獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)常用誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的外源生長激素主要為細(xì)胞分裂素，生長素含量則相對較少。安佰義[39]在研究不同培養(yǎng)基作用于叢生芽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低溫處理后的外植體在WPM培養(yǎng)基上叢生芽誘導(dǎo)率最高，MS培養(yǎng)基次之，B5培養(yǎng)基最低。王新等[70]用鳳丹鱗芽培養(yǎng)時，也證實(shí)了WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高。但也有研究顯示，初代培養(yǎng)基為MS時，外植體生長發(fā)育快，葉柄長；培養(yǎng)基為WPM時，其生長發(fā)育減慢，且葉柄較短[71]。馬俊[72]也表示，在牡丹的初代培養(yǎng)中，比較理想的培養(yǎng)基為鈣離子濃度加倍的MS培養(yǎng)基。也有人認(rèn)為關(guān)于牡丹最適的初代培養(yǎng)基是半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基[73-74]，其誘導(dǎo)叢生芽的效果顯著優(yōu)于MS基本培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)是指在初代培養(yǎng)獲得無菌材料后再進(jìn)行的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。其目的是為了得到一定數(shù)量的無根苗，然后用獲得的無根苗邊繁殖邊生根，其后代數(shù)量按幾何級數(shù)快速增加。繼代培養(yǎng)基通常選用分化培養(yǎng)基，而且不同外植體在繼代時所需要的培養(yǎng)基也不同。王燕霞等[75]以洛陽紅為試材研究6種不同培養(yǎng)基(MS、1/2MS、C17、WPM、B5、DKW)對繼代苗增殖生長的影響時發(fā)現(xiàn)，DKW培養(yǎng)基最適合其繼代增殖。孟清秀等[76]研究表示，牡丹品種菱花湛露的最佳增殖培養(yǎng)基為改良WPM培養(yǎng)基。張桂花等[30]通過對豆綠、大胡紅、黑花魁和金星雪浪的鱗芽進(jìn)行培養(yǎng)研究，認(rèn)為MS為最佳繼代培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)的周期同樣也對牡丹組織培養(yǎng)產(chǎn)生影響，多數(shù)研究表明，在第3～4周，牡丹組培苗的質(zhì)量最佳，生長量大；第4～5周，組培苗生長量增加不大，但不定芽可以充分生長。因此，牡丹組織培養(yǎng)以4或5周為繼代周期較好[77-78]。

植物組織培養(yǎng)過程中生長調(diào)節(jié)劑的配比非常重要，直接影響苗和根的形成[79]。不同植物在不同生長階段其所需要的生長調(diào)節(jié)劑種類和配比均不相同，另外，不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比不同，其誘導(dǎo)效果也不同，其中生長素和細(xì)胞分裂素的使用起著至關(guān)重要的作用。牡丹組培常用的生長素有NAA、2,4-D、IAA、IBA；細(xì)胞分裂素有6-BA、KT、TDZ、ZT。另外，赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)在牡丹組織培養(yǎng)中也很重要。

不同種類的細(xì)胞分裂素在牡丹組織培養(yǎng)過程中的影響不同，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，6-BA[80-81]是對牡丹葉芽最為重要的細(xì)胞分裂素，與其他激素同時使用效果會減弱，在增殖培養(yǎng)中只有6-BA能促進(jìn)不定芽的發(fā)生。隨后更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，6-BA和GA3同時使用效果較單獨(dú)使用6-BA更好，但在低鈣濃度下會出現(xiàn)莖尖和葉片枯死。因此，不能長時間使用同時含有6-BA和GA3的培養(yǎng)基，應(yīng)盡可能地間斷使用[68]。另外6-BA、KT和TDZ單獨(dú)使用可促進(jìn)牡丹腋芽發(fā)育[82-83]，但增殖率都比較低，低濃度的TDZ、6-BA和KT合用能顯著提高腋芽形成和叢生芽形成。另外不同激素組合可以對牡丹增殖系數(shù)產(chǎn)生較大差異的影響，研究人員利用極差分析結(jié)果表明，6-BA、KT、NAA 3種激素對增殖數(shù)的影響逐漸降低[35]。

生長素有利于營養(yǎng)器官伸長生長，可以使細(xì)胞進(jìn)入持續(xù)分裂的增殖狀態(tài)。牡丹鱗芽增殖實(shí)驗(yàn)表明，NAA對其影響比較顯著[84]；對于牡丹組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA的正向效果極其顯著[39]。在牡丹組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)生長素與細(xì)胞分裂素有協(xié)同作用，搭配使用時其濃度比例不同誘導(dǎo)效果也不同，一般來說細(xì)胞分裂素高時有助于芽的分化，細(xì)胞分裂素含量較低時，則有助于根的形成。

1.2.3 培養(yǎng)環(huán)境條件

除外植體及培養(yǎng)基種類之外，濕度、溫度、光照和pH值等因素也嚴(yán)重影響著牡丹組織培養(yǎng)結(jié)果的成敗。現(xiàn)階段公認(rèn)的最適合牡丹組織培養(yǎng)的環(huán)境條件如下：溫度為(25±1) ℃，光強(qiáng)為1 500～2 000 lx，光照時間是每天10～12 h，培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。

濕度是組培過程中一個較重要的因素，研究表明，將濕度控制在70%上下較為適宜[85]，因?yàn)檫^低會使培養(yǎng)基滲透壓升高，影響植株健康生長；過高則易造成污染。另外溫度的控制也很重要，研究發(fā)現(xiàn)24～26 ℃時,試管苗生長快、長勢壯、且芽分化多，表現(xiàn)最佳[30]。

光照因子對牡丹組培的影響較多，主要有光強(qiáng)、光質(zhì)、光照時間等，大部分的研究表明，光強(qiáng)為1 500～2 000 lx，光照周期為12 h的光照條件最佳。對于光質(zhì)的現(xiàn)有研究則表明，70%紅光+30%藍(lán)光的冷光燈處理35 d后，組培苗的葉片數(shù)、株高及莖長等均達(dá)到理想效果[86]。

1.3 影響生根的主要因素

生根是組培過程中非常重要的階段，受多種因素影響，包括培養(yǎng)基成分[87-88]和環(huán)境因素[89-90]。生根困難是牡丹增殖體系確定過程中最受關(guān)注的問題，包括生根質(zhì)量差以及體外培養(yǎng)存活率低[91]。因此，生根問題的解決將是牡丹組培中一個很重要的突破。

總結(jié)所有研究發(fā)現(xiàn)，牡丹組培苗誘導(dǎo)生根可分為 3種：(1)速蘸法，將組培苗浸泡在高濃度IBA溶液中，迅速接種到只含活性炭不加任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基上；(2)一步生根法，外植體誘導(dǎo)生根時在含有低濃度IBA的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)[22]；(3)兩步生根法，先將組培苗在含高濃度IBA的培養(yǎng)基上進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后在僅含有活性炭的培養(yǎng)基上生根。大量實(shí)驗(yàn)證明，兩步法是目前為止最常用且效果最好的方法[92]。此外蔗糖濃度也嚴(yán)重影響組培苗的生根數(shù)量，充足的糖類化合物能提高牡丹組培苗的生根率，并同時促進(jìn)根和莖的生長[93-94]。

牡丹內(nèi)含有大量的酚酸化合物，對其體外生根有一定的影響[95]。有報(bào)道稱酚酸在植物生物和非生物脅迫下積累[99]并控制不定根的形成和發(fā)展[96-97]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，牡丹組培苗中含有12種酚酸化合物，內(nèi)源性酚酸含量的變化與其體外生根密切相關(guān)，其中二元酚有利于體外生根[98]。

2 制約牡丹組織培養(yǎng)發(fā)展的主要因素

2.1 污染

污染現(xiàn)象在組培過程中經(jīng)常出現(xiàn)，且一旦出現(xiàn)污染就容易造成失敗。易引起污染的原因有很多，如接種人員以及外植體帶菌、操作環(huán)境及接種工具滅菌消毒不徹底、操作不規(guī)范、外植體內(nèi)生菌較多等等。因此，實(shí)驗(yàn)過程需嚴(yán)格按照操作要求進(jìn)行，杜絕接種前污染。組培室以及操作間需定期進(jìn)行消毒，經(jīng)常用酒精噴霧降塵消毒，并用紫外線照射消毒滅菌。對于接種后的污染，要根據(jù)外植體種類的不同尋找不同的消毒方式進(jìn)行預(yù)防，選擇合適的方法和消毒劑，適當(dāng)情況下可進(jìn)行多次滅菌。植物內(nèi)生菌導(dǎo)致的污染，則可在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素或適宜的抑菌劑，從而降低污染率。

2.2 褐化現(xiàn)象

褐化是組織培養(yǎng)中最重要的問題，其會引起外植體代謝紊亂，最終將導(dǎo)致死亡。外植體的品種、取材部位、年齡、取材時間以及培養(yǎng)基種類、組培室溫度等等均與褐化相關(guān)。研究表明，年齡老、高度分化、木質(zhì)化程度高的外植體材料很容易褐化，而較嫩、分化程度低的材料褐化程度相對較輕[99]。牡丹是多糖多酚植物，繼代時外植體基部愈傷被切除，切口處的酚類物質(zhì)會被氧化形成深褐色的醌類物質(zhì)，這些物質(zhì)在多酚氧化酶、酪氨酸酶等作用下，導(dǎo)致其他代謝通路不穩(wěn)定，最終使外植體衰老死亡。由于各個品種牡丹植株內(nèi)的總酚含量不同，因此關(guān)于影響牡丹褐化的因素，研究人員們做了大量研究。牡丹花型繁多，花型越復(fù)雜，越容易發(fā)生褐變，這是因?yàn)橹仓曜陨矶喾友趸负渴请S花型演化程度的增加而增加的。而且溫度會影響多酚氧化酶的活性，研究表明，木本植物在溫度較低的冬春季取材褐化率較低；一般越小的外植體褐化越嚴(yán)重，故而選取適宜大小的外植體可有效降低褐化率。

另外培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及抗褐化劑的添加也會對褐化造成一定程度的影響。不同培養(yǎng)基添加的無機(jī)鹽離子濃度各不相同。牡丹葉柄培養(yǎng)常用的 3種培養(yǎng)基：WPM、1/2MS和MS培養(yǎng)基，其培養(yǎng)過程中外植體褐化程度依次加重[100]。因此，外植體褐化程度與培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度呈正相關(guān)。在培養(yǎng)過程中適當(dāng)?shù)牡蜏豙101]和黑暗[27]處理可以緩解褐化的發(fā)生，這是由于溫度和光照與多酚氧化酶的活性相關(guān)。此外在黑暗條件下，6-BA能引起多酚氧化酶活性提高，而2,4-D和IAA可以減少多酚合成[102]，所以適當(dāng)?shù)募に嘏浔纫部梢詼p輕褐化發(fā)生。由于牡丹組織培養(yǎng)發(fā)生褐化是一種酶促反應(yīng)，選擇合適的褐化抑制劑、抗氧化劑和吸附劑可以抑制酶的活性，從而使褐化程度降低。常用的有抗壞血酸(Vc)、AgNO3、Na2S2O3、PVP、活性炭(AC)。Vc可以將Cu2+還原為Cu，而后產(chǎn)生的螯合物可以抑制酶的活性；吸附劑對褐化的抑制作用為 PVP>AC[100]，且AC容易聚集在外植體傷口處，阻礙其吸收營養(yǎng)。

2.3 玻璃化現(xiàn)象

玻璃化是植物在組培過程中極易出現(xiàn)的生理病變或生理失調(diào)現(xiàn)象，多表現(xiàn)為葉片縱向卷曲或腫脹，表皮角質(zhì)層蠟質(zhì)缺少，葉片脆弱易碎；組培苗含水量高，存活率低。已報(bào)道80多種植物組培時出現(xiàn)玻璃化[103]。玻璃化的牡丹苗葉柄較粗，葉片肥厚，半透明狀，植株呈充水狀，與凍害植株形態(tài)極其相似。由于玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生將導(dǎo)致組培苗病變死亡，因此解決玻璃化現(xiàn)象將有利于提升組織培養(yǎng)技術(shù)的成功率。

2.4 生根困難和移栽成活率低

目前，牡丹組織培養(yǎng)體系建立過程中最難解決的問題仍在組培苗生根以及馴化移栽過程。因?yàn)槟档そM培苗生根率低且生根質(zhì)量差，且大多數(shù)不定根由愈傷產(chǎn)生，不定根與植株之間沒有直接連接，另外生根誘導(dǎo)過程中外源IBA的使用會導(dǎo)致植株內(nèi)源ABA大量積累，繼而導(dǎo)致植株分裂能力下降，出現(xiàn)休眠現(xiàn)象，所以移栽成活率低。為了建立合適的馴化移栽體系，研究人員作了大量的工作，包括組培苗生根狀態(tài)、移栽季節(jié)、基質(zhì)的選擇以及后期管理等方面的關(guān)鍵技術(shù)。研究證實(shí)，待生根后1個月，根長達(dá)到3～4 cm時移栽成活率最高[105]，主要是因?yàn)檫^早移栽植株適應(yīng)力差，抵抗力弱；過晚移栽時根系木質(zhì)化程度大，吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力變差。移栽時應(yīng)選擇晝夜溫差大、溫度適宜的秋季，以便移栽苗健康生長。

試管苗種植成活過程中另一個重要的因素就是基質(zhì)的選擇。一般而言，基質(zhì)的質(zhì)地要疏松透氣，同時有良好的保水性，還要容易消毒等。常用的基質(zhì)有蛭石粉、珍珠巖、草炭土、腐殖質(zhì)等。通常認(rèn)為蛭石粉+草炭土(1∶1)更適宜組培苗生長[34]。

2.5 成本高

組織培養(yǎng)技術(shù)雖然在一定程度上可以縮短傳統(tǒng)育種年限，短時間內(nèi)獲得大量幼苗，達(dá)到一定經(jīng)濟(jì)效益，但總體來看，其成本仍然相對較高。無論是培養(yǎng)基、外植體、蔗糖等物資，還是人力的消耗，再加上組培苗成活率低、移栽困難等問題導(dǎo)致其處于高成本技術(shù)范疇。

3 組培新技術(shù)

常規(guī)的組織培養(yǎng)中，研究人員一直將重心放在培養(yǎng)基篩選、激素配比及外植體的種類選擇等方面。事實(shí)上光照、溫濕度、CO2濃度等對小植株生長的影響也很大，因此研究人員提出了關(guān)于組培的新技術(shù)：光自養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)/無糖培養(yǎng)技術(shù)，植物開放式組織培養(yǎng)以及開放式光自養(yǎng)微繁技術(shù)。

光自養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)(photoautotrophic micropropagation)又稱無糖培養(yǎng)技術(shù)(sugar-free micropropagation)，是指組織培養(yǎng)過程中改變碳源供給途徑，并控制環(huán)境因子，從而促進(jìn)植株光合作用速率，使外植體生長由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型[106]。光自養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)不需要蔗糖為碳源，大量降低了雜菌的繁殖速率；且培養(yǎng)容器向大型化發(fā)展，降低了傳統(tǒng)培養(yǎng)中，容器較小，環(huán)境較密閉，瓶內(nèi)氣體不流通，相對濕度較高等問題；另外，傳統(tǒng)培養(yǎng)中多使用瓊脂等凝膠物質(zhì)為支撐材料，組培苗根系脆弱，馴苗困難，而該技術(shù)多使用塑料泡沫、蛭石、成型巖棉等多孔性無機(jī)材料，價格低廉且大多可重復(fù)使用，很大程度上降低了成本。而且這些材料通氣性好，可有效促進(jìn)植株根系生長。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于光自養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)的研究多集中在培養(yǎng)室環(huán)境[107-109]、培養(yǎng)容器大小[110-111]、CO2的輸入[112-113]、支撐材料[114]等等。研究表明，與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，光自養(yǎng)培養(yǎng)獲得的組培苗生長快且長勢較好，畸形苗少，生根率和成苗率較高。另外，培養(yǎng)過程中污染率大幅降低，使得試管苗馴化期間的成活率大幅上升。

植物開放式組織培養(yǎng)是指無需高壓蒸汽滅菌，在超凈工作臺外的操作環(huán)境用普通容器進(jìn)行接種工作的新型技術(shù)，培養(yǎng)基中添加適量抑菌劑，可在自然開放的有菌環(huán)境中進(jìn)行操作[115]。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，其從根本上簡化了操作環(huán)節(jié)，成本也極度降低、可大規(guī)模生產(chǎn)試管苗。關(guān)于開放式培養(yǎng)的研究多集中于抑菌劑的挑選上，這是因?yàn)檎麄€操作過程不在無菌的條件下進(jìn)行，污染便成了關(guān)鍵問題。崔剛等[116]運(yùn)用中醫(yī)理論，從多種植物中提取了具有廣譜性殺菌、抗菌的物質(zhì)，并成功地建立了葡萄開放式組織培養(yǎng)體系。目前荸薺[117]、香蕉[118]、魔芋[119]、白菜[120]等植物均已成功建立了開放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系，關(guān)于牡丹的相關(guān)技術(shù)則尚未見報(bào)道。開放式組織培養(yǎng)大力推動了組培苗工廠化發(fā)展，為今后研究提供了新思維。

開放式光自養(yǎng)微繁技術(shù)，就是將兩種新興技術(shù)結(jié)合在一起的方法，即在開放有菌的環(huán)境下，將外植體接種在含有合適抑菌劑，并且無糖的容器中。這一技術(shù)將兩個新興技術(shù)完美地融合在一起，既簡化了消毒過程，同時使組培室環(huán)境得到改善。但開放式光自養(yǎng)培養(yǎng)對植物生長、發(fā)育的影響研究還比較有限詳細(xì)，尚未見成熟技術(shù)體系的報(bào)道。

4 展望

關(guān)于牡丹組織快繁的研究一直是牡丹研究人員關(guān)注的重點(diǎn)，這對于保存優(yōu)良牡丹品種，縮短育種年限以及提高存活率有極大的幫助。雖然還沒有呈現(xiàn)出一個完整的技術(shù)體系，但已經(jīng)有了較成熟的基礎(chǔ)。比如關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的褐化、玻璃化、生根困難等問題均已得到一定程度的解決，研究人員的關(guān)注點(diǎn)也不再局限于基礎(chǔ)的激素配比上，更多的集中于體細(xì)胞培養(yǎng)以及分生結(jié)節(jié)誘導(dǎo)方面，進(jìn)而從根本上解決牡丹愈傷分化能力的問題。

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，我國牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究應(yīng)在原有的基礎(chǔ)上放寬視野，可進(jìn)一步針對牡丹組織培養(yǎng)進(jìn)行新技術(shù)的研究，從而加快工廠化的推進(jìn)，或與轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子技術(shù)相結(jié)合，從而致力于與抗性、花期、花色等優(yōu)良性狀相關(guān)的牡丹品種的研究。另外，牡丹的藥用價值也是關(guān)注重點(diǎn)，可通過多學(xué)科技術(shù)的結(jié)合，深層次地掌握其代謝途徑。