核酸檢測應用于無償獻血者乙型肝炎病毒篩查的效果分析

周美潔 吳軍軍 吳敏珍 祝文堅 梁宇

（廣西梧州市中心血站 廣西 梧州 543002）

2010年6月開始，國家衛生計生委在全國進行核酸檢測試點工作，以持續提高我國血站的血液篩查技術，確保臨床輸血的安全。2016年3月1日實施的《血站技術操作規程》（2015版）規定，核酸檢測正式納入到無償獻血者血液篩查的檢測方法中。作為ELISA法血液檢測的有益補充，NAT有效縮短了病毒檢測窗口期，降低輸血傳播傳播病原體的殘余風險，特別是對于隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的檢出發揮了重要作用[1]。我站于2014年12月開始對部分獻血者血液標本進行核酸檢測，2015年10月全面對獻血者血液進行核酸篩查，本文對梧州地區2015年1月至2017年8月38496份無償獻血者血液核酸檢測HBV篩查結果進行分析，現報告如下。

1.材料與方法

1.1 標本來源

收集2015年1月至2017年8月梧州市中心血站無償獻血者血液標本38496人份，每次獻血者同時留取兩份血液標本，分別用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和核酸檢測（NTA）。根據《血站技術操作規程》要求，核酸標本需要在采集4h內3500×g離心15min，2～8℃冰箱保存，72小時內完成檢測，如因特殊情況72小時內不能完成檢測的，離心后24小時內在-20℃以下凍存。血液標本的標識、包裝和運輸過程符合國家相關要求。

1.2 儀器與試劑酶免檢測儀器

TECAN SCHWEIZ公司全自動酶免工作站TECAN FREEDOM EVOLYZER-2200；瑞士HAMILITON公司Microlab FAME全自動酶聯檢測分析儀；核酸檢測儀器：美國諾華公司Procleix TIGRIS SYSTEM核酸檢測系統（轉錄介導的擴增技術-TMA），美國CHIRON公司試劑孵育儀RPI，ELGA純處理水系統。ELISA檢測試劑：北京萬泰乙肝表面抗原診斷試劑盒，珠海麗珠乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒；NAT試劑：美國諾華公司的HBV、HCV、HIV-1NAT試劑盒（TMA法）。所有試驗試劑經國家食品藥品監督管理部門批準，每批試劑經過質量抽檢，并進行確認合格后使用。

1.3 方法

對無償獻血者的標本同步進行酶免試驗和核酸檢測。ELISA試驗：由酶免實驗室檢測人員嚴格遵照實驗室操作規程，采用2種不同的試劑對樣本進行HBSAg檢測，結果判斷標準：S/CO≥1為陽性，判斷結果為不合格，對血液進行隔離報廢；NAT檢測：由核酸實驗室工作人員采用全自動核酸檢測系統及配套試劑盒（TMA-化學發光法）對血液同步進行HBV、HCV、HIV-1核酸聯合檢測，若血樣核酸聯合檢測呈陽性反應，且ELISA檢測HBSAg陽性，則認為核酸檢測HBV-DNA呈反應性，不需繼續進行后續的核酸鑒別試驗。對核酸聯合檢測呈反應性而ELISA檢測HBSAg陰性的標本進行HBV、HCV、HIV-1核酸鑒別檢測，任一項呈反應性，判斷為陽性。留取HBV-DNA陽性標本血清1ml，送梧州市某三級醫院進行乙肝血清標志物五項檢測。對HBsAg陰性而HBV-DNA陽性獻血者進行隨訪，2個月后采集其血樣進行HBsAg和HBV-DNA復檢，留取血清送檢乙型肝炎病毒血清標志物五項。在后續檢測中HBV-DNA持續陽性，HBsAg發生陽性轉化則定為HBV免疫“窗口期”；后續檢測HBsAg仍為陰性，而HBV-DNA持續陽性和/或抗-HBc和/或抗-HBs陽性，則定為“隱匿性”HBV感染。

1.4 統計學處理

對本站38496份無償獻血者血液HBV篩查結果進行統計分析。計數資料采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 同步進行ELISA和NAT篩查的38496份無償獻血者血液中，采用血清學ELISA法檢測HBsAg陽性，且HBV、HCV、HIV-1核酸聯合檢測陽性樣本共132例，占全部樣本的0.34%（132/38496），即血清學檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.34%；對271例ELISA結果為陰性、NAT聯合檢測結果為陽性的樣本進行鑒別實驗，HBV-DNA陽性樣本數101例，占全部樣本的0.26%(101/38496)，即ELISA檢測乙型肝炎病毒的漏檢率2.6‰，病毒核酸檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.61%(233/38496)。兩種檢測方法HBV陽性率比較見表1。

表1 兩種檢測方法HBV陽性率比較

2.2 82 例初次酶免實驗HBsAg陰性而核酸檢測HBV-DNA陽性標本送醫院實驗室進行乙型肝炎五項檢測（化學發光法），其中抗-HBc陽性64例（占78.04%），抗-HBs陽性34例（占41.46%），抗-HBe陽性21例（25.61%占），HBeAg均為陰性，結果見表2。

表2 82例HBV-DNA陽性標本初次送檢乙肝五項檢測結果

2.3 對22例初次酶免實驗HBsAg陰性而核酸檢測HBV-DNA陽性的獻血者進行隨訪，2個月后追蹤檢測的結果顯示：16例追蹤樣本仍為HBV-DNA陽性，判定為隱匿性乙肝；6例追蹤樣本檢測HBV-DNA陰性，懷疑初檢HBV-DNA假陽性或病毒載量過低未檢出；未發現后續檢測中發生HBsAg陽性轉化標本。

3.討論

隱匿性乙肝感染是酶免檢測主要的漏檢原因之一[2]，大量證據表明，隱匿性HBV感染的血液可引起HBV經輸血傳播[3]。目前，NAT技術在我國已經全面覆蓋應用到無償獻血者血液篩查中。通過本次研究發現：（1）我站完成38496份獻血者樣本中，血清學檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.34%，病毒核酸檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.61%；ELISA檢測乙型肝炎病毒的漏檢率2.6‰。核酸檢測HBV陽性率與ELISA檢測陽性率差異具有統計學意義（P＜0.01），證實了核酸檢測可以很大程度上提高HBV的檢出率，降低了ELISA方法檢測漏洞的風險。（2）根據HBsAg陰性、核酸檢測HBV-DNA陽性標本乙型肝炎五項檢測結果顯示，大多數抗-HBc為陽性，建議在獻血者血液篩查中，血清學檢測增加抗-HBc項目，這樣可以在一定程度上降低乙肝病毒漏檢的風險。（3）在追蹤隨訪的樣本中，6例HBV-DNA后續檢測呈陰性反應，懷疑部分標本初次核酸檢測為假陽性，也可能因為病毒復制和表達水平過低或宿主方面等的因素導致病毒未能檢出；未發現后續檢測中發生HBsAg陽性轉化標本，即未發現HBV“窗口期”感染，可能酶免試劑的靈敏度、本次研究樣本量大小等因素有關，需持續提高檢測質量，繼續對以后檢出陽性樣本進行追蹤檢測。

綜上所述，病毒核酸檢測應用于無償獻血者乙型肝炎病毒篩查，可以提高不合格標本的檢出率，有效降HBV經輸血傳播的風險，進一步保障了臨床輸血的安全性。