獲得性凝血功能異常患者血漿糾正試驗(yàn)與狼瘡抗凝物質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)性探討

羅儉權(quán)，朱柏桂，邱 飛，陶珊花，馮天斌

(四會(huì)市人民醫(yī)院，廣東 四會(huì) 526200)

活化部分凝血活酶時(shí)間(APPT)是開展術(shù)科醫(yī)院的凝血功能常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,凝血功能異常的患者，主要表現(xiàn)為獲得性途徑凝血異常，APPT延長(zhǎng)，凝血活酶生成不良，而血小板功能計(jì)數(shù)、出血時(shí)間、PT、TT、vWF：Ag均正常，鑒別通過血漿糾正試驗(yàn)，以推斷患者血漿中是否產(chǎn)生狼瘡抗凝物質(zhì)(LA),盡快診斷患者狼瘡抗凝物質(zhì)存在情況，將避免發(fā)生易栓癥,降低嚴(yán)重體循環(huán)障礙和出血風(fēng)險(xiǎn)。本研究開展APPT血漿糾正結(jié)果推斷狼瘡抗凝物質(zhì)濃度的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料：收集2015年1月～2017年10月在我院診斷的獲得性凝血功能異常患者110例,輕型72例(66%)，中間型26例(23%)，重型12例(11%)。其中男73例，女37例，年齡19～78歲，平均34.5歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《出凝血異常與血凝學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷指南》及推薦危險(xiǎn)因素標(biāo)準(zhǔn)分型[1]。

1.2樣本采集：靜脈真空采血管采用廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)的檸檬酸鈉抗凝管，患者空腹抽血2 ml,2 500×g離心15 min分離血漿待測(cè),無任何凝集、溶血、黃疸及脂血現(xiàn)象。同一患者按照狼瘡抗凝物質(zhì)結(jié)果分成三組:狼瘡抗凝物質(zhì)陰性組78例(71%)，陽性組32例(29%)，其中陽性低濃度抗凝物質(zhì)21例，陽性高濃度抗凝物質(zhì)11例。

1.3儀器及試劑：SYSMEX CS2100全自動(dòng)血凝分析儀(希森美康醫(yī)用有限公司生產(chǎn))及其原裝配套試劑和定標(biāo)血漿質(zhì)控品(e-check低、中、高值)。

1.4方法：①制備正常混合血漿(PNP)：混合至少20人份正常人血漿[2]。②采用APPT糾正試驗(yàn)，包括即刻法APPT及孵育法APPT糾正試驗(yàn)。將患者血漿與正常混合血漿量按1∶1比例混合，即刻及37℃孵育2 h后分別測(cè)定APPT。PNP 150 μl與高濃度抗凝物質(zhì)血漿150 μl混合作為標(biāo)準(zhǔn)血漿，PNP 150 μl與患兒 血漿150 μl混合作為待測(cè)血漿； 將標(biāo)準(zhǔn)血漿與 待測(cè)血漿置于 37℃孵育 2 h后檢測(cè)血漿延長(zhǎng)時(shí)間關(guān)系，根據(jù)待測(cè)血漿血漿延長(zhǎng)時(shí)間表現(xiàn)推斷與抑制物濃度的關(guān)系，截取最接近標(biāo)準(zhǔn)血漿50%糾正單位，應(yīng)用公式log對(duì)數(shù)計(jì)算抑制物濃度，然后 乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為該份標(biāo)本的抑制物濃度。③狼瘡抗凝物質(zhì)(LA)篩選：進(jìn)行一期凝固法檢測(cè)APPT。④狼瘡抗凝物質(zhì)(LA)確診試驗(yàn)：用奎蛇毒試劑激活凝血因子FX，加入Ca和低濃度磷脂，檢測(cè)血漿凝固的發(fā)生時(shí)間，稱為Russell蛇毒時(shí)間(RVVT)。若RVVT明顯延長(zhǎng)，提示有凝血因子缺陷或存在LAC。加入正常血漿后RVVT縮短，則為凝血因子缺陷；若RVVT仍延長(zhǎng)，提示有LAC存在。加入高濃度的磷脂中和LAC后，可使延長(zhǎng)的RVVT縮短或恢復(fù)正常，確證血漿中存在LAC狼瘡抗凝物質(zhì)陽性。通過以APPT凝固點(diǎn)參數(shù)，進(jìn)行dRVVT試驗(yàn)，檢測(cè)血漿中的LA。設(shè)置計(jì)算的cutoff值(t/c)設(shè)為1.2以下，得出確診試驗(yàn)檢測(cè)值[3]。

1.5狼瘡抗凝物質(zhì)(LA)比值：應(yīng)用以上兩個(gè)完整的檢測(cè)項(xiàng)目為標(biāo)準(zhǔn)，符合國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)委員會(huì)發(fā)布的針對(duì)狼瘡抗凝/磷脂依賴性抗體的LA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。參考值：狼瘡抗凝物比值(SLC-R)=0.8～1.2。LA比值(SLC-R)=LA篩選試驗(yàn)檢測(cè)值(SLC-S)/確診試驗(yàn)檢測(cè)值(SLC-C)。LA比值>2.0為高濃度。LA比值=1.5-2.0為低濃度，LA比值比值<1.2為陰性[4]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS的統(tǒng)計(jì)軟件錄入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用各組APPT結(jié)果及狼瘡抗凝物質(zhì)比值進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)分析,求出各自參數(shù)水平用中位數(shù)表示。應(yīng)用等級(jí)相關(guān)系數(shù)Spearman非正態(tài)檢驗(yàn)分別對(duì)三組APPT與狼瘡抗凝物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用非參數(shù)法構(gòu)建繪制ROC曲線,計(jì)算正確診斷指數(shù)約登指數(shù)(Youden′s index′s index),即是靈敏度和特異度之和減去1的最大切點(diǎn)為臨界點(diǎn),對(duì)孵育法APPT進(jìn)行兩次切分,確定診斷值界點(diǎn)。計(jì)量資料采用四格表的χ2檢驗(yàn)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果與狼瘡抗凝物質(zhì)(LA)比值的相關(guān)性：將三組APPT試驗(yàn)結(jié)果與LA比值通過SPSS進(jìn)行正態(tài)性w檢驗(yàn),均呈非正態(tài)分布。相關(guān)性結(jié)果顯示三種方法的APPT檢驗(yàn)結(jié)果均與LA比值呈明顯的相關(guān)性。但孵育的APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果，較原血漿、即刻法與LA比值相關(guān)性更顯著。見表1。

表1110例分組 APPT 與LA濃度關(guān)系

類別中位數(shù)(s)r值P值原血漿APPT101.6(49.7～210.2)0.55<0.05即刻法APPT36.5(33.0～102.5)0.69<0.05孵育法APPT39.1(32.7～115.8)0.93<0.01

2.2繪制ROC曲線，評(píng)估孵育法APPT結(jié)果預(yù)測(cè)LA比值陽性的診斷界點(diǎn)。

2.2.1LA陽性和陰性臨界點(diǎn)預(yù)測(cè)：以LA陽性(+)人群和LA陰性(-)人群作為ROC曲線分析的切點(diǎn),對(duì)孵育的APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果分析，ROC曲線下面積(AUC)=0.95(95% CI 0.961～0.987),Youden′s index值為0.819,所對(duì)應(yīng)的孵育的APPT糾正試驗(yàn)秒數(shù)為39.6s(95% CI38.1～42.9),表示診斷狼瘡抗凝物質(zhì)陽性的最佳臨界點(diǎn)。此時(shí)敏感度為88.0%,診斷特異度為94.9%，見圖1，見表2。

圖1 孵育法APPT診斷抑制物有無的ROC曲線

表2診斷界點(diǎn)為39.6 s時(shí)兩組人群的分布情況

組別孵育法APPT(s) <39.6 ≥39.6 合計(jì)陰性組70878陽性組75259合計(jì)7760137

注：χ2=142.5,P<0.05

2.2.2LA陽性組中低比值與高比值臨界點(diǎn)預(yù)測(cè):對(duì)于LA陽性人群,以2.0作為分界點(diǎn)分為高濃度組(LA比值>2.0)和低濃度組(LA比值≤1.2～2.0)。利用ROC曲線對(duì)孵育法APPT預(yù)測(cè)LA低比值、高比值的臨界點(diǎn)進(jìn)行分析。AUC=0.971(95%CI0.962～0.994),Youden′s index值為0.879,所對(duì)應(yīng)的孵育法APPT為53.6s(95%CI48.5～80.2),可以鑒別低比值與高比值LA的最佳診斷界點(diǎn)。此時(shí)敏感度為94.7%,診斷特異度為96.3%。見圖2，見表3。

圖2 孵育法APPT診斷LA低比值、高比值的ROC曲線

表3診斷界點(diǎn)為 53.6s 時(shí)低、高比值LA的分布預(yù)測(cè)

組別孵育法APPT(s) <53.6 ≥53.6 合計(jì)低濃度組35540高濃度組11819合計(jì)362359

注：χ2=86.2,P<0.01

3 討論

APPT是獲得性凝血系統(tǒng)較敏感和最為常用的篩選試驗(yàn)[5]，若異常抗凝物增多，一些患者存在狼瘡抗凝物(LAC)，使APTT延長(zhǎng)，需進(jìn)一步開展糾正試驗(yàn)，如正常血漿和吸附血漿能糾正延長(zhǎng)的結(jié)果而血清不能糾正，則為因子Ⅷ缺乏；如吸附血漿不能糾正，其余兩者都能糾正，則為因子Ⅸ缺乏；如三者都不能糾正，則為病理性循環(huán)抗凝物質(zhì)，可以預(yù)測(cè)患者形成狼瘡抗凝物L(fēng)AC陽性的可能性[6]。狼瘡抗凝物是一種能延長(zhǎng)凝血時(shí)間的獲得性自身抗體，是一種會(huì)增加動(dòng)靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)性的蛋白質(zhì)。以IgG型或IgM型或兩者共存，是發(fā)生易栓性疾病的危險(xiǎn)信號(hào)[7]。一旦狼瘡抗凝物質(zhì)大量形成,就可能造成獲得性凝血功能異常患者的血栓形成,獲得性凝血功能異常患者往往病情隱匿，更易導(dǎo)致嚴(yán)重血栓形成和溶栓出血事件[8]。臨床逐步體會(huì)到抗凝物質(zhì)問題的嚴(yán)峻性。抗凝物質(zhì)的定性及定量監(jiān)測(cè),目前常用的抗凝物質(zhì)檢測(cè)方法包括篩查方法和確診方法[9]。雖然可以明確抗凝物質(zhì)比值情況,但上述方法對(duì)試驗(yàn)技術(shù)要求較高，受到檢測(cè)試劑費(fèi)用昂貴、操作步驟繁瑣、難以標(biāo)準(zhǔn)化等因素的限制,我國(guó)現(xiàn)階段可開展抗凝物質(zhì)確診試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室較少，操縱復(fù)雜，報(bào)告周期長(zhǎng),短時(shí)間內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)普及[10]。

通過本文的相關(guān)性研究，從表1、圖1、圖2、表2結(jié)果表明應(yīng)用孵育法APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果高于39.6 s，能預(yù)測(cè)患者血漿中可能存在狼瘡抗凝物(LAC),高于53.6 s，可以預(yù)測(cè)狼瘡抗凝物(LAC)存在高濃度。當(dāng)孵育法APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果提示患者有LAC產(chǎn)生時(shí)，提示抗凝物質(zhì)存在與否,及高、低濃度水平區(qū)分預(yù)測(cè)值。顯示孵育法APPT糾正試驗(yàn)與抗凝物質(zhì)比值之間的相關(guān)性明顯高于原血漿及即刻的APPT,提示孵育的APPT可以更好地反應(yīng)抗凝物質(zhì)比值高低,結(jié)果越高,抗凝物質(zhì)比值越高,這與理論值是相一致的[11-13]。所以，構(gòu)建繪制ROC曲線，可以利用血漿糾正試驗(yàn)結(jié)果，建立預(yù)測(cè)獲得性凝血功能異常患者狼瘡抗凝物質(zhì)的臨界范圍診斷值，即通過孵育的APPT預(yù)估抗凝物質(zhì)比值區(qū)間。從ROC曲線分析，孵育法APPT結(jié)果預(yù)測(cè)抗凝物質(zhì)陰性與陽性比值臨界點(diǎn)AUC為0.959,低濃度與高濃度抗凝物質(zhì)AUC為0.971,統(tǒng)計(jì)學(xué)上提示兩者均得到了較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。以孵育法APPT糾正試驗(yàn)結(jié)果39.6 s、53.6 s作為診斷臨界值時(shí),可以獲得較高的診斷敏感度和診斷特異度,其Youden′s index值也最大值。因此，血漿糾正試驗(yàn)可以作為內(nèi)源性凝血功能異常患者LA產(chǎn)生的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。可作為抗凝物質(zhì)監(jiān)測(cè)的前期預(yù)試驗(yàn)常規(guī)開展，在現(xiàn)階段無法開展抗凝物質(zhì)定量監(jiān)測(cè)醫(yī)療單位的補(bǔ)充，能解決早期判斷?監(jiān)測(cè)抗凝物質(zhì)發(fā)生的重要篩查方法。