黑枸杞水提物對小鼠疲勞 及運動性心肌損傷的改善作用

楊巨峰,王 奇,孫 晶,馮大志,*

(1.錦州醫科大學體育教研部,遼寧錦州 121001 2.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

黑枸杞即黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.),為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.),是西北干旱地區一種有的多年生灌木野生植物。黑枸杞富含多糖、有機酸、不飽和脂肪酸、原花青素、蛋白質、氨基酸、黃銅類化合物、甜菜堿、多酚類化合物、維生素和礦物質等營養物質[1]。研究表明黑枸杞干果多糖的含量可達到10.89%～16.74%[2],花青素含量可達3690 mg/100 g,總花色苷的含量達386.9 mg/100 g[1]。已有研究表明黑枸杞不僅具有抗腫瘤、增強免疫[3],抗損傷[4]、降血糖[5]、降血脂[6]等作用,而且還有抗氧化[7-8]、抗疲勞[9]和抗心肌損傷[8]的作用。汪建紅等[10]研究表明黑枸杞多糖能明顯的抗疲勞作用,曹茸茸等[11]也證明藏藥黑枸杞也有緩解小鼠運動疲勞的作用。目前,對黑枸杞各功能性成分的抗疲勞和抗運行性心肌損傷作用雖有一些研究,但黑枸杞果實的抗疲勞作用研究較少,而從心肌細胞形態學方面探究其抗損傷機制還尚未見報道,本實驗通過小鼠耐力試驗、抗疲勞血液生化指標及組織形態學方面探究黑枸杞水提物抗疲勞作用及對運動性心肌損傷的改善作用,為其成為功能性運動保健食品研制和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞 青海格爾木源鑫堂生物科技有限公司;西洋參膠囊 通化萬通藥業股份有限公司生產;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血乳酸(blood lactic acid,BLA)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肝糖原(liver glycogen,LG)、肌糖原(muscle glycogen,MG)的試劑盒 南京建成生物工程研究所;Bouin’s固定液 北京索萊寶科技有限公司;SPF級健康昆明系小鼠 雄性,體重18～22 g,生產許可證號:SCXK(遼)2014-004,由錦州醫科大學實驗動物中心提供;SPF級無菌鼠料 北京科奧協力飼料有限公司。

XSC型小鼠恒溫游泳池 北正華生物儀器設備有限公司;3-18KS離心機 德國Sigma公司;ADVIA 2400型全自動生化分析儀 德國Bayer公司;JA5003A型精密電子天平 上海精天電子儀器有限公司;半自動切片機HS-3315 金華市華速科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑枸杞水提物的制備 黑枸杞水提取物的提取方法為浸漬法。稱取黑枸杞50 g,放于裝有1000 mL蒸餾水的燒杯中,于70 ℃恒溫避光浸漬4 h后,過濾,將濾液用旋轉蒸發儀在70 ℃下旋轉蒸發回收溶劑過濾,將濾液定容到125 mL(終濃度為400 mg/mL)。然后將400 mg/mL的提取物配制成0.05、0.10、0.15 g/mL;放于4 ℃的冰箱中避光待用。

1.2.2 動物分組及給藥 小鼠分籠飼養,5 只/籠,室溫(22±2) ℃,相對濕度 50%±10%,噪音小于 60 dB,日光燈的明暗間隔為 12 h,自由飲食和飲水。適應性喂養一周后,將60只雄性ICR小鼠隨機分安靜對照組、空白對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組10只。在小鼠飼喂30 min后用灌胃針進行灌胃,灌胃藥物及含量詳見表1。陽性對照組灌服西洋參膠囊依參考文獻[12]為500 mg/kg·bw(成年人每日攝入量10倍),換算為配制成0.05 g/mL,低、中、高劑量組分別換算為0.05、0.10、0.15 g/mL黑枸杞水提物,各組灌劑量均為0.1 mL/10 g體重。每3 d稱重1次,以調整灌服劑量,每天早上(9:00～11:00)根據體重經口灌胃給藥1次,每天除安靜對照組外其余各組小鼠灌胃30 min后進行游泳訓練,每5 d為1個周期,第一個周期游泳訓練時間為5 min,每過一個周期游泳時間增加5 min,訓練6個周期,安靜對照組不參與游泳訓練,各組小鼠在相同條件下進行常規飼養和管理。

1.2.3 小鼠體重測定 灌胃飼養前和末次灌胃后,分別稱量各組小鼠的體重,并記錄。

1.2.4 負重游泳時間測定 末次給藥30 min后,在小鼠尾根部負以小鼠體重5%的鉛皮,置于恒溫游泳池中游泳,水深30 cm,水溫(25±0.5) ℃,記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間(小鼠頭部全部沉入水中8 s不抬頭),即小鼠負重游泳時間。

1.2.5 小鼠抗疲勞血清生化指標的測定 小鼠負重力竭游泳后,休息1 d,并進行無負重游泳30 min,休息10 min后,眼球采血,離心,制備血清,備用。將采血后的小鼠立即取肝臟和股四頭肌肉,經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干,保存,備用。按照試劑盒提供方法檢測血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)、血乳酸脫氫酶(LDH)及肝糖原(LG)、肌糖原(MG)水平。

1.2.6 組織形態學觀察 將安靜對照組小鼠處死,取安靜對照組及各組部分心肌組織,浸于Bouin’s固定液固定48 h,制備常規石蠟切片,HE染色,于100×10顯微鏡下觀察心肌組織結構。

1.3 統計學方法

2 結果與分析

2.1 黑枸杞水提物對小鼠體重的影響

由表1可知,與空白對照組相比,安靜對照組、陽性對照組和低、中、高劑量組小鼠的體重均無顯著差異(p>0.05),說明低、中、高劑量的黑枸杞水提物對小鼠的體重無顯著的影響。

表1 黑枸杞水提物對小鼠體重的影響Table 1 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on body weight of mice

2.2 黑枸杞水提物對小鼠負重游泳時間的影響

由表2可知,與空白對照組相比,陽性對照組、低、中、高劑量組第1、2、3、4周小鼠均能極顯著的延長負重游泳時間(p<0.01);與陽性對照組相比,低劑量組第1、2、3、4周負重游泳時間差異亦均極顯著(p<0.01),高劑量組除第一周差異不顯著外,其他周差異均顯著(p<0.05),中劑量組除第2周差異顯著外,其他時間差異均不顯著(p>0.05);而低、中、高劑量組間在第1～4周也均表現出差異的顯著性(p<0.01,p<0.05),其中中劑量組的效果最佳。說明黑枸杞水提物對小鼠的疲勞有顯著的拮抗作用,增強小鼠的抗疲勞性,中劑量組灌胃劑量的作用效果更好。

表2 黑枸杞水提物對小鼠負重游泳時間的影響(s,n=10)Table 2 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on weight-loaded swimming time in mice(s,n=10)

2.3 黑枸杞水提物對小鼠血液生化指標的影響

由表3可知,與安靜對照組相比,空白對照組血液中BLA和BUN的含量均有極顯著提高(p<0.01),血液中LDH含量無統計學意義(p>0.05),說明力竭游泳運動可顯著提高血液中BLA和BUN的水平增高,而對血液中LDH的水平沒有明顯的影響。

表3 黑枸杞水提物對小鼠血液生化指標的影響(n=10)Table 3 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on contents of BLA,BUN and activity of LDH in mice after exercise(n=10)

與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠血液中BLA和BUN水平均有不同程度的降低,BLA水平低劑量組差異顯著(p<0.05),中、高劑量組差異極顯著(p<0.01),BUN水平低、高劑量組差異顯著(p<0.05),中劑量組差異極顯著(p<0.01);低、中、高劑量組中小鼠血液中LDH的水平均有不同程度的提高,低、高劑量組差異顯著(p<0.05),中劑量組差異極顯著(p<0.01)。說明黑枸杞水提物能顯著降低力竭小鼠血液中BLA和BUN的水平,提高LDH的水平,延緩疲勞的產生,其作用效果與灌喂的劑量有關,但不隨劑量的增加而增強。與陽性對照相比,低、高劑量組小鼠血液中BLA和BUN的水平均顯著增高(p<0.05),血液中的LDH的水平顯著降低(p<0.05),中劑量組中各項指標差異均不顯著(p>0.05);說明黑枸杞水提物對力竭小鼠的抗疲勞作用與西洋參膠囊作用基本一致,其中以中劑量組的劑量效果更佳。

由表4可知,與安靜對照相比,空白對照組的肝糖原和肌糖原水平均極顯著降低(p<0.01),說明力竭運動導致肝糖原和肌糖原過度消耗。與空白對照組相比,低、中、高劑量組小鼠肝糖原和糖原水平均有顯著提高,低、高劑量組差異顯著(p<0.05),中劑量組差異(p<0.01)極顯著,說明黑枸杞水提物能顯著增加力竭小鼠的肝糖原和肌糖原的儲備,延緩疲勞的出現。與陽性對照組相比,低、高劑量組肝糖原和肌糖原的水平均顯著降低,中劑量的肝糖原和肌糖原水平均無統計學意義,說明黑枸杞水提物與西洋參膠囊一樣具有防止力竭小鼠肝糖原和肌糖原的過度降低,延緩疲勞的發生,提高機體的運動能力,且以中劑量組的劑量效果更佳。

表4 黑枸杞水提物對小鼠肝糖原 和肌糖原的影響(n=10)Table 4 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on contents of MG and LG in mice after exercise(n=10)

2.4 黑枸杞水提物對小鼠抗心肌運動損傷的影響

如圖1可知,安靜對照組細胞核分布均勻,形態呈橢圓形,體積適中,細胞間隙適中。空白對照組細胞核分布不均勻,形態趨近線形,細胞間隙明顯增大。陽性對照組細胞核分布均勻,形態呈橢圓形,細胞間隙小。低劑量組細胞核分布不均勻,形態趨近線形,細胞間隙增大。中劑量組細胞核分布均勻,形態呈橢圓形,體積適中,細胞間隙小。高劑量組細胞核分布不均勻,形態呈橢圓形或線形,胞間隙不均勻。說明黑枸杞水提物能改善心肌細胞間隙和心肌細胞的分布的均勻程度,提高心肌抗損傷能力。

圖1 黑枸杞水提物對心肌細胞的影響Fig.1 Effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on cardiac myocyte注:A:安靜對照組;B:空白對照組;C:陽性對照組; D:低劑量組(0.05 g/mL);E:中劑量組(0.1 g/mL); F:高劑量組(0.15 g/mL)。

3 結論與討論

運動耐力是評價機體疲勞的一個重要指標[13]。負重游泳時間的長短可以較好地反映動物運動抗疲勞程度。負重游泳運動導致全身的肌肉收縮,持續性肌肉收縮造成機體供氧不足而啟動糖酵解路徑提供能量,同時產生大量的乳酸,乳酸濃度增加使肌肉H+和無機磷堆積,導致肌肉組織內的pH下降,改變肌肉組織內環境,導致疲勞的產生[14]。而血液中的LDH可加速血液中乳酸分解清除,抑制了疲勞的產生或者加速疲勞的消除,因此,血乳酸和乳酸脫氫酶的水平是反應機體疲勞產生和消除速度的重要指標。尿素氮是蛋白質、氨基酸等物質分級代謝的產物,當機體長時間不能從糖類、脂肪的代謝中獲得足夠的能量時,蛋白質的分解代謝就會增強,進而提供機體所需的能量,同時產生更多的尿素氮,氨中毒可能影響中樞神經系統關鍵區域的持續協調活動[15]。所以,血清尿素氮含量是評價疲勞程度的另一個重要指標[16]。已有研究表明黑枸杞果實中的多糖、花青素等成分均具有抗疲勞作用,汪建紅等[9]報道黑枸杞果實多糖能能延長小鼠的負重游泳時間,增強小鼠血清和肝臟的 SOD 活性,降低 MDA 的含量,提高肝糖原、肌糖原的儲備量,降低小鼠運動后血清尿素和血乳酸水平。古麗達娜等[17]報道黑果枸杞色素對小鼠耐缺氧、抗疲勞游泳能力具有明顯的增強作用。本研究表明低、中、高劑量組均能極顯著的延長小鼠爬桿和負重游泳時間,對小鼠體重無顯著的影響。能顯著降低力竭小鼠血液中BLA和BUN的水平,提高血液中LDH的水平,其中以中劑量組的效果更為顯著,說明黑枸杞水體物能提高小鼠血清中LDH水平,加速消除血液中乳酸的分解,降低乳酸的含量,同時,具有使小鼠運動后的血清尿素氮含量下降的功能,且與灌喂的劑量有關。這可能與黑枸杞水體物中的含有的多糖、青花素等成分具有抗疲勞的作用有關,關于黑枸杞水提物的有效成分及含量還有待于進一步研究。

分解脂肪和碳水化合物是骨骼肌運動過程中能量的主要來源,而糖原是能源生產的主要糖源[18]。運動能量最初來源于糖原分解,當劇烈運動導致肌糖原耗盡時,則能量會來源于肝糖原的釋放[19];因此,血糖、肝糖原、肌糖原是反映耐受疲勞能力的重要指標。本研究表明黑枸杞水提物能不同程度地提高小鼠肝糖原和肌糖原的水平,其中中、高劑量組肝糖原和肌糖原水平差異顯著。說明黑枸杞水體物能有效的提高小鼠的肝糖原和肌糖原的水平,為力竭小鼠提供能量儲備,其主要原因可能是黑枸杞水提物中含有多糖、花色苷等營養物質,貯存在小鼠的肝臟和肌肉中,為機體提供了能源儲備,延緩了蛋白質和氨基酸分解代謝,降低了血尿素氮水平,延緩了疲勞的產生。