一種發酵麩皮多糖的提取 及其對大鼠的抗氧化作用

安曉萍,王 園,史俊祥,段元霄,張倩茹,孟子琪,李 暄,齊景偉

(內蒙古農業大學動物科學學院,內蒙古呼和浩特 010018)

小麥麩皮作為小麥加工面粉的主要副產物,是一種重要的膳食纖維來源,對機體保持健康狀態發揮著重要的作用。麩皮的利用常集中在飼料領域,其價值沒有得到充分的發揮。麩皮中除含有一定數量的淀粉、蛋白質、脂肪外,還含有46%左右的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)[1],包括果膠多糖、纖維素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合鏈β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等組成的非纖維素多糖[2]。大量研究表明,麩皮多糖具有諸多可貴的生物活性,包括抗氧化[3]、免疫調節[4-5]和益生作用[6]等。因此,麥麩多糖已經在食品工業、發酵工業等領域嶄露頭角。

微生物發酵法是一種常用的食品、飼料加工技術。麩皮經過微生物處理后,其物理特性和營養價值均能夠得到改善[7-8]。小麥麩皮經過酵母菌或乳酸菌為菌種的液態發酵后,可溶性阿拉伯木聚糖、酚酸含量、抗氧化活性均有提高[9-11]。崔晨曉等[12]以酵母菌為菌種進行小麥麩皮固態發酵,同樣提高了可溶性阿拉伯木聚糖和總酚含量。與液態發酵法相比,固態發酵法具有成本低、條件溫和、不受設備限制且多糖轉化率較高的優點。

前期研究已利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌固態發酵了小麥麩皮,發現發酵麩皮多糖含量可達130.21 mg/g,且具有一定的抗炎活性[13-14],但發酵麩皮多糖的組成及其抗氧化活性仍有待于進一步研究。因此,本文通過對發酵麩皮粗多糖提取工藝進行優化,測定其單糖組成,并選用健康的雄性Wistar大鼠為研究對象,采用腹腔注射敵草快(Diquat)建立大鼠氧化應激模型,研究發酵麩皮多糖的抗氧化活性,以期為在生產中將發酵麩皮多糖應用于改善機體健康狀況提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar大鼠 健康無菌級,雄性,斷奶,36只,內蒙古醫科大學試驗動物中心(SCXK(蒙)2015-0001);釀酒酵母CGMCC 2.119、枯草芽孢桿菌CGMCC 1.0892 動物科學學院水產實驗室保存;麩皮、豆粕粉、玉米粉 市購;甲醇、三氟乙酸、氯仿、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 色譜純,天津市康科德科技有限公司;甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖 美國Sigma公司;營養肉湯培養基、麥芽汁液體培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;總蛋白定量、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidasa,GSH-Px)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)ELISA試劑盒 武漢基因美生物科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

YX-18LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SW-CJ型超凈工作臺 上海新苗醫療器械;GX2型智力光照培養箱 寧波東南儀器有限公司;SH2-82型旋轉氣浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭中旺實驗儀器廠;TG16-WS型臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司;Epoch2型微孔板分光光度計 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態發酵小麥麩皮 將保藏的釀酒酵母和枯草芽孢桿菌分別接種于滅菌(121 ℃,0.1 MPa)的麥芽汁培養基和營養肉湯培養基中,培養24 h(37 ℃,120 r/min),使菌體濃度達到108cfu/mL,以6.73∶3.26的比例組成復合菌種液。發酵底物為麩皮80.46%、豆粕粉9.32%和玉米粉10.22%,總接種量10.4%,料水比為1∶1.16 (w/v,g/mL),置于35.4 ℃發酵52.7 h[13-14]。發酵結束后,于45 ℃烘箱中烘干(24 h)后粉碎過60目篩。

1.2.2 發酵麩皮多糖提取工藝研究 采用水提醇沉法,取干燥后發酵麩皮10 g,以一定料液比,一定溫度,水浴浸提一定時間,離心(5000 r/min,15 min)取上清液,上清液加入4倍體積的95%乙醇,靜置過夜,離心(5000 r/min,15 min)收集沉淀,沉淀凍干備用。利用單因素試驗研究浸提溫度、浸提時間和料水比對發酵麩皮多糖產量的影響。

浸提溫度設定為50、60、70、80、90、100 ℃(固定料液比1∶20,浸提時間30 min);浸提時間設定為10、20、30、60、90、120 min(固定料液比1∶20,固定浸提溫度80 ℃);浸提料水比(w/v,g/mL)設定為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(固定浸提溫度80 ℃,浸提時間30 min)。

1.2.3 發酵麩皮多糖含量測定 采用葡萄糖苯酚-硫酸分光光度法測定發酵麩皮多糖含量。發酵麩皮多糖含量由下列公式計算得出:

發酵麩皮多糖含量(mg/g)=[發酵麩皮多糖液濃度(mg/mL)×發酵麩皮多糖液體積(mL)]/[固體浸提物的質量(g)]

1.2.4 發酵麩皮多糖單糖組成的測定

1.2.4.1 發酵麩皮多糖酸水解 稱取凍干的發酵麩皮多糖樣品2 mg,加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液0.5 mL,在120 ℃條件下水解2 h。氮吹儀吹干。

1.2.4.2 標準品溶液的制備 分別精確稱取單糖標準品10 mg,溶解于1 mL水溶液中,配制成10 mg/mL的母液。各取5 μL單糖標準品母液加入至0.5 mL TFA溶液(2 mol/L)中,與樣品同時在120 ℃條件下水解2 h。氮吹儀吹干。

1.2.4.3 PMP柱前衍生 向完全酸水解干燥后得到的樣品中加入0.5 mL PMP甲醇溶液(0.5 mol/L)和0.5 mL NaOH溶液(0.3 mol/L),充分混勻后于70 ℃水浴反應30 min。冷卻至室溫,加入0.5 mL HCl溶液(0.3 mol/L)中和。加入0.5 mL氯仿反復萃取3次,離心(5000 r/min,5 min)取上清液,經0.22 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.2.4.4 色譜條件 色譜柱為SHISEIDO C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0);流動相B為乙腈水溶液(82∶18,v/v);流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量10 μL;采用VWD測器檢測,檢測波長為245 nm。

1.2.5 發酵麩皮多糖對大鼠抗氧化功能的影響

1.2.5.1 動物試驗設計 本試驗選用雄性Wistar大鼠36只,經過一周的適應期,隨機分為6組。低劑量組(low-dose,CL)、中劑量組(middle-dose,CM)和高劑量組(high-dose,CH):每天分別灌服100、200和400 mg/kg發酵麩皮多糖粗制品;陽性對照組(positive control,PC):100 mg/kg維生素C;陰性對照組(negative control,NC):空白攻毒;正常對照組(control,CT):空白不攻毒。試驗期14 d。試驗結束當天,除CT組外,其它5組大鼠腹腔注射敵草快0.1 mmol/kg,CT組注射等量生理鹽水,攻毒24 h后處死。

1.2.5.2 血漿和肝臟組織樣品的制備 大鼠攻毒前禁食12 h,自由飲水,攻毒后24 h后乙醚致暈,心臟采血,并采集肝臟樣本。血液樣品采集后立即放置在冰盒中,離心(4 ℃,3000 r/min)10 min,血漿保存于-20 ℃,用于測定抗氧化功能相關指標。肝臟樣本用生理鹽水洗凈后,裝入無菌采樣袋,浸入液氮,取出后-80 ℃冷凍保存。測定時,用含NaCl濃度為0.86%磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)勻漿,離心(4 ℃,3000 r/min)10 min,得到的上清液用于抗氧化功能相關指標測定。

1.2.5.3 血漿和肝臟組織中抗氧化指標的測定 總蛋白定量、T-AOC、CAT、GSH-Px、GSH、SOD及MDA定量測定根據ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 數據處理

采用SAS 8.1統計軟件GLM模型進行單因素方差分析,多重比較采用Duncan’s檢驗,p<0.05為差異顯著。發酵麩皮多糖提取試驗均重復6次,動物試驗每組6個重復。

2 結果與分析

2.1 發酵麩皮多糖提取工藝優化

由圖1A可知,當浸提溫度在50～80 ℃范圍內變化時,發酵麩皮多糖含量隨浸提溫度的升高逐漸增加(p<0.05),浸提溫度在80 ℃時,提取效果最佳;在80～100 ℃范圍內,發酵麩皮多糖含量小幅度上升后維持穩定(p>0.05)。考慮到升溫過程能源浪費比較嚴重,增加提取成本,故將浸提溫度定為80 ℃。

由圖1B可知,當浸提時間在10～30 min范圍內變化時,發酵麩皮多糖含量隨浸提時間的延長逐漸增加(p<0.05),浸提溫度達到30 min時,發酵麩皮多糖含量達到最大,延長浸提時間,發酵麩皮多糖含量沒有顯著變化(p>0.05)。考慮到縮短生產時間,降低提取成本,故將浸提時間確定為30 min。

由圖1C可知,當浸提料水比在1∶10～1∶20 (w/v,g/mL)范圍內變化時,發酵麩皮多糖含量隨浸提料水比的增加而增加(p<0.05),當浸提料水比為1∶20 (w/v,g/mL)時,發酵麩皮多糖含量達到最大,浸提料水比在1∶20～1∶40 (w/v,g/mL)范圍內變化時,發酵麩皮多糖含量不再繼續增加(p>0.05)。提取液的增加有利于溶質的溶出,但過大的浸提料水比會增加溶劑的消耗,提高對提取設備的要求,會給后續濃縮干燥帶來不便,因此,故將浸提料水比確定為1∶20。

圖1 浸提條件對發酵麩皮多糖含量的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on fermented wheat branpolysaccharides production注:標示不同字母表示差異顯著(p<0.05); 含有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

根據上述單因素試驗結果,確定出的發酵麩皮多糖最佳提取條件為浸提溫度80 ℃、浸提時間30 min和浸提料水比1∶20 (w/v,g/mL)。此條件下重復6次提取發酵麩皮多糖,得到發酵麩皮多糖含量為(151.57±3.25) mg/g,較提取工藝優化前發酵麩皮多糖含量(130.21±3.78) mg/g提高了21.36 mg/g。程彥偉等[15]研究確定的麩皮多糖最佳提取工藝為料水比1∶20 (w/v,g/mL)、提取溫度100 ℃、提取時間2 h。康波等[16]利用單因素試驗結合正交試驗,確定出麥麩多糖的最佳條件為料液比1∶25 (w/v,g/mL)、提取時間4 h和提取溫度100 ℃。本試驗所得到的浸提溫度相對較低,浸提時間較短,說明微生物發酵可能會破壞牢固的化合鍵,使麩皮多糖釋放出來,因此,提取過程不需要過高的溫度和過長的時間。

2.2 發酵麩皮多糖的單糖組成

混合標準單糖及發酵麩皮多糖酸水解衍生液的HPLC色譜圖如圖2所示。由圖可見,發酵麩皮多糖的單糖組成包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖,其摩爾比分別為2.70∶0.62∶100.20∶4.34∶7.80∶12.23∶35.17,發酵麩皮多糖具有以葡萄糖為主的基本結構組成特征。王忠合等[17]利用超聲波法提取麥麩多糖并用液相色譜法對其進行單糖組分測試,結果顯示:單糖組成為葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖,其比例為1.21∶0.57∶0.84∶1。Madhukumar等[18]用氣相色譜法對水提醇沉制得的小麥麩皮水溶性多糖的化學組成成分進行了分析,結果表明,該小麥麩皮水溶性多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖按摩爾比1.3∶21.2∶38.5∶1.6∶26.4∶11.3組成。熊慧薇等[19]利用氣相色譜法測定了麥麩膳食纖維中的單糖成分為鼠李糖、阿拉伯、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其比例為5.7∶103.9∶100.7∶7.3∶62.8∶9.8。本試驗所測發酵麩皮多糖除了有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖,還含有巖藻糖,其中以葡萄糖含量最高,這可能是由于在微生物發酵過程中纖維素和半纖維素更多的被利用,促進發酵原料中植物多糖的溶出,且微生物自身也產生了胞外多糖。

圖2 混合標準單糖(A)及發酵麩皮 多糖酸水解衍生液(B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard monosaccharides(A) and derivatives of fermented wheat bran polysaccharides(B)

2.3 發酵麩皮多糖對大鼠血漿及肝臟組織中抗氧化相關指標的影響

2.3.1 大鼠血漿中抗氧化相關指標的變化 大鼠血漿中抗氧化相關指標如表1所示,與CT組相比,NC組中血漿CAT、GSH-Px和SOD活性、T-AOC以及GSH含量顯著降低(p<0.05),而MDA含量顯著升高(p<0.05)。CM組、CH組和PC組的GSH-Px活性顯著高于NC組(p<0.05),其中CM組顯著低于CT組(p<0.05),CH組、PC組與CT組差異不顯著(p>0.05);CL組、CM組的MDA含量顯著低于NC組,卻顯著高于CT組(p<0.05);PC組的GSH含量顯著高于NC組,卻顯著低于CT組(p<0.05)。這表明灌胃發酵麩皮多糖可以緩解由敵草快引起的大鼠血漿中抗氧化相關酶和GSH含量的降低,抑制MDA水平的升高,并且具有劑量依賴效應。

2.3.2 大鼠肝臟組織中抗氧化指標的變化 大鼠肝臟組織中抗氧化相關指標如表2所示,與CT組相比,NC組肝臟組織中T-AOC和GSH-Px活性以及GSH含量顯著降低,而MDA含量顯著升高(p<0.05)。CH組肝臟組織中T-AOC、GSH-Px活性和GSH含量顯著高于NC組(p<0.05),與CT組差異不顯著(p>0.05);PC組肝臟組織中T-AOC和GSH-Px活性顯著高于NC組(p<0.05),與CT組差異不顯著(p>0.05),GSH含量顯著低于CT組(p<0.05);CL組、CM組、CH組和PC組肝臟組織中MDA含量顯著低于NC組(p<0.05),其中CL組、CH組和PC組與CT組差異不顯著(p>0.05)。這表明灌胃發酵麩皮多糖可以緩解由敵草快引起的大鼠肝臟組織中抗氧化相關酶和GSH含量的降低,抑制MDA水平的升高,并且同樣具有劑量依賴效應。

表2 發酵麩皮多糖對大鼠肝臟組織中抗氧化相關指標的影響Table 2 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on theantioxidative status in the liver of rats

敵草快是二吡啶基除草劑,它能利用分子氧產生超氧陰離子和過氧化氫,繼而產生其它自由基,誘導機體產生氧化應激[20]。本試驗中,敵草快攻毒后的大鼠血漿和肝臟組織中T-AOC水平、CAT、SOD和GSH-Px活性以及GSH含量急劇下降(p<0.05),MDA含量顯著上升(p<0.05),表明本試驗氧化應激模型建立成功。灌服發酵麩皮多糖處理組大鼠血漿和肝臟組織中總抗氧化能力、抗氧化酶和GSH含量均高于敵草快攻毒組,MDA水平低于敵草快攻毒組,其中高劑量組大鼠的部分抗氧化指標恢復到正常組的水平,并且作用效果優于灌胃100 mg/kg維生素C。這一結果與Higuchi等[3]、Wang等[21]和王軍等[22]對麩皮多糖抗氧化活性的研究結果一致。

3 結論

發酵麩皮多糖水提醇沉法試驗結果表明,在料水比1∶20 (w/v,g/mL),溫度80 ℃,提取30 min,發酵麩皮多糖含量較高,可達到151.57 mg/g。獲得的發酵麩皮多糖的單糖組成比例為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖2.70∶0.62∶100.20∶4.34∶7.80∶12.23∶35.17。灌胃發酵麩皮多糖對由敵草快誘導的大鼠氧化應激,有一定的緩解作用,可通過提高抗氧化酶和GSH含量,降低脂質過氧化的發生。