直接進樣-質譜檢測指紋圖譜技術 結合化學計量學研究干燥方法 對黃花菜質量的影響

劉 偉,趙 楊,蘇東林,李高陽,單 楊,*

(1.湖南省農業科學院湖南省農產品加工研究所,湖南長沙 410125; 2.中南大學隆平分院,湖南長沙 410125 3.貝茲維爾人類營養研究中心,美國馬里蘭 20705)

黃花菜(Hemerocallisfulva)又名金針菜,為百合科多年生草本植物,是我國的特色蔬菜之一。黃花菜營養豐富,含有大量糖類、維生素及多種人體必需的氨基酸,具有平肝養血、消腫利尿、抗菌消炎等功能[1-7]。目前,我國黃花菜種植面積約60萬畝,其中主要分布在湖南、陜西、甘肅、山西4個產區[2],年產鮮黃花菜56～80萬噸,加工干制黃花菜10～16萬噸,產值達100億元以上。

黃花菜采收期集中,采后10 h就黃化、開放、衰老,降低了其營養價值和商品價值,且由于采摘時間一般在早晨,露水較重,病原微生物極易侵染,加之采后環節中的機械損傷,在采后24 h就開始變質。常溫下新鮮黃花菜耐存性差,用普通薄膜包裝,一般2 d后全部開花,4 d后腐爛[1-2]。干制加工是當前黃花菜延長貯藏保質期的唯一途徑。黃花菜的干制只有小部分采用烘干機械或機械化的烘烤廠房,大部分農戶依然采用傳統的太陽曬干的方式,即用蒸煮后進行太陽曬干,但遇陰雨天氣易出現大量發霉變質,降低黃花菜商品品質[2]。目前,在食品行業廣泛應用的干燥方法有普通熱風干燥、微波干燥、遠紅外干燥、真空冷凍干燥等[8-12],研究主要集中在紅棗、胡蘿卜等大宗干制農產品品質的影響,而黃花菜干制方面的研究極少,不同干燥方法黃花菜化學成分的變化尚未報道。

指紋圖譜已被廣泛應用于食品原料質量控制和加工過程監控等研究中,在食品工業現代化進程中起到了尤為重要的作用。采用不同的分離手段(色譜、光譜)及檢測器,可以得到不同類型的指紋特征。直接進樣-質譜檢測指紋圖譜技術(FIMS)是一種新穎、高效的指紋圖譜技術,其最大特點是樣品在經過提取、濾過后不需要色譜分離,直接導入質譜儀分析,在1～2 min即得到樣品的總離子流圖和質譜信息[13-17]。質譜原始數據經預處理后,通過主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),可以建立化學判別式及選擇化學標記物預判未知樣品的信息,直觀、深入地分析原料或產品質量[18-24]。此方法結合化學計量學能有效評估不同樣品在化學成分方面的相似性和差異性,同時,采用超高效液相色譜高分辨率質譜(UHPLC/HRMS)進行指紋圖譜分析有助于樣品中代表性化學標記物的鑒別。目前,此方法已被應用于中藥材、植物材料、膳食補充劑及水果等多種領域[13,25]。

本實驗以黃花菜為原料,采用直接進樣-質譜檢測指紋圖譜技術結合化學計量學快速分析自然干燥、熱風干燥、真空冷凍干燥3種不同干燥方法的黃花菜,對其代表性的成分進行研究,篩選出代表性的特征成分,為黃花菜的加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黃花菜(品種:猛子花) 均于7月采自湖南省衡陽市祁東縣,根據色澤和外形,選擇均一的成熟度進行采收,一般為抽穗后大約27～35 d,所有的樣品在采摘后30 min內送到實驗室,并在4 ℃儲存待干燥處理;乙腈、甲醇 美國Fisher Scientific公司;甲酸 美國Sigma/Aldrich公司,其他試劑 均為分析純。

Thermo Fisher LTQ Orbitrap XL質譜儀,包括Accela 1250二元泵、PAL-HTC-Accela自動進樣器、Accela 1250 PDA檢測器、G1316A Agilent柱溫箱、ESI 離子源、Xcalibur工作站 美國賽默飛世爾科技有限公司;AL 204型十萬分之一分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ 5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司;微量移液器 德國Eppendorf公司;FD-2真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;熱風干燥加工線 新發食品有限公司自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃花菜的干燥 真空冷凍干燥:真空度0.6 Pa,溫度-50 ℃,干燥時間24 h,干燥至水分含量10%左右。每個樣品重復3次,10組樣品標記為1～30。

自然干燥:黃花菜在100 ℃ 蒸汽漂燙2 min后,在太陽下涼曬48 h,至水份含量10%左右。每個樣品重復3次，10組樣品標記為31～60。

熱風干燥:黃花菜在100 ℃ 蒸汽漂燙2 min后,在55 ℃熱風干燥箱中干燥9 h,至水份含量10%左右。每個樣品重復3次，10組樣品標記為61～90。

樣品干燥后粉碎過80目網篩,收集于密封袋中室溫保存待分析。

1.2.2 樣品制備 取干燥后黃花菜粉末樣品0.30 g,置于15 mL離心管中,加入10.0 mL甲醇-水溶液(70∶30,v/v),室溫下700 W超聲提取60 min,提取液于5000 r/min離心15 min,取上清液稀釋100倍后過0.45 μm微孔濾膜,即得待測樣品提取液。為了減少化合物分解所引起的誤差,所有樣品分析在提取后24 h內完成。FIMS分析,每個樣品重復3次,進樣量5 μL。

1.2.3 FIMS條件

1.2.3.1 色譜條件 C18保護柱(Adsorbosphere All-Guard Cartridge,5 μm,4.6 mm×7.5 mm);流動相為0.1%甲酸乙腈和甲酸水溶液(50∶50)等度洗脫,流量0.5 mL/min;進樣量為5 μL,每個樣品平行進樣5次,每次分析時間為2 min。

1.2.3.2 質譜條件 采用ESI離子源,在負離子模式下采集數據。數據采集范圍m/z 100～1500。質譜參數通過Xcalibur軟件的自動優化,參數為:采用電噴霧離子源(ESI),鞘氣為80單位,輔助氣為15單位,噴霧電壓為-4.5 kV,毛細管溫度為300 ℃,毛細管電壓為-40.0 V,套管透鏡補償電壓為-150 V。

1.2.4 FIMS的數據采集 樣品經高效液相色譜儀自動進樣系統吸取,通過C18保護柱濾除雜質(以減少對質譜檢測器的污染),不經色譜柱分離直接進入質譜檢測器檢測。在樣品的檢測過程中,采用全掃描模式,掃描范圍為100～1500 m/z,每個樣品平行進樣3次。

1.3 數據處理

質譜分析獲得的響應離子強度與化合物質荷比組成的數據,經Xcalibur軟件處理后導入Excel辦公軟件和多元數據分析軟件Simca-P 11.5(瑞典Umetrics公司)進行UV標度化預處理,進行PCA和PLS-DA分析,對黃花菜進行成分評價和判別。

2 結果與分析

2.1 3種不同干燥處理黃花菜的FIMS指紋圖譜分析

對3種不同干燥處理黃花菜進行了FIMS指紋圖譜分析,在負離子模式下質譜圖見圖1。在本研究中,樣品不通過色譜柱進行分離,經保護柱濾除雜質以后直接進行質譜分析,每次分析只需2.0 min。從圖中可以看出,負離子模式下質譜圖給出離子信息豐富,響應強度較高的離子主要集中在m/z 100～1000,除了m/z 191.06、259.09、341.11、503.16這4個強度最高的離子以外,m/z 421.15、609.15、665.21、711.22、827.27及989.32等離子也出現較高的響應強度。同時,不同處理的樣品的共有離子響應強度存在差異,表明不同干燥處理黃花菜含有相似化學組成,而其含量各不相同。

圖1 負模式下不同干燥處理黃花菜的質譜圖Fig.1 Representative MS for treatment of daylily in negative modes

FIMS與其它指紋圖譜技術相比最大的優勢在于可完成對大量樣品的快速分析。本實驗的30批不同干燥處理黃花菜的質譜分析僅需60 min。通過質譜數據的直觀分析,可以發現不同干燥處理黃花菜在負離子模式下的相似信息及不同干燥處理后差異較大的離子信息。然而,總離子流圖中的大量離子信息僅直觀分析不能科學、全面地反映樣品之間的差異,需要合化學計量學方法進一步的深入分析。同時,為了增加數據分析的可靠性,樣本平行分析3次。

2.2 PCA分析

由質譜響應離子強度與化合物質荷比組成的數據經Xcalibur軟件處理后導入Excel,通過LCQ程序完成對數據的預處理,以m/z 100～1000的881個離子(取整數)的離子強度為變量,對90(30×3)個樣本進行PCA分析,3個主成分(PC1、PC2和PC3)對總方差的貢獻率較大(91.2%),其分別達到了54.2%、21.6%和15.4%。分別以前2個和前3個主成分建立坐標系進行投影,即可得到所有樣本在二維平面的分布,結果見圖2。

圖2 不同干燥處理黃花菜的PCA得分圖Fig.2 PCA scores plot for treatment of daylily

圖2是負離子模式下黃花菜在二維平面上的得分投影圖。由圖2可知3種處理的黃花菜樣品較好的分成了3類。為了便于說明,將得分圖分為4個象限。1象限在PC1的負半軸,PC2的正半軸,分布于此象限的樣品在PC1得分值小于0,在PC2大于0;2象限在PC1和PC2的正半軸,分布于此象限的樣品在PC1和PC2得分值都大于0;3象限在PC1和PC2的負半軸,分布于此象限的樣品在PC1和PC2得分值都小于0;4象限在PC1的正半軸,PC2的負半軸,分布于此象限的樣品在PC1得分值大于0,在PC2小于0。由圖2可以看出,不同干燥處理的黃花菜分別位于不同的象限區域,其中編號為31～60的自然干燥樣品分布于得分圖的右側,位于第2和4象限之間;編號為61～90的熱風干燥樣品分布于得分圖的上部偏左,位于第1象限;編號為1～30的真空冷凍干燥樣品分布于得分圖的左下方,位于第3象限,而13、14、15號樣品分布異常,遠離數據集。

從不同干燥處理黃花菜在PC1和PC2的得分上來看,編號為31～60的自然干燥樣品在PC1上的得分值都大于0,分布于這個區域的所有樣品中,51和35號樣品分別得到最高和最低的PC1值,31和57號樣品分別得到最高和最低的PC2值;編號為61～90的熱風干燥樣品在PC1上的得分值均小于0,在PC2上的得分值均大于0,86和73號樣品分別得到最高和最低的PC1值,73和90號樣品分別得到最高和最低的PC2值;編號為1～30的真空冷凍干燥樣品在2個主成分上的得分值均小于0,21和2號樣品分別得到最高和最低的PC1值,8和19號樣品分別得到最高和最低的PC2值。由于不同處理樣品在得分圖上3個局域的PC1和PC2的得分差異,使得30個不同干燥處理黃花菜的之間存在相似性或差異性。

2.3 PLS-DA分析

在負離子模式下PCA分類信息的基礎上,以m/z 100～1000的881個離子(取整數)的離子強度為變量,對90(30×3)個樣本進行PLS-DA,使組內差異最小化,組間差異最大化。

通過PLS-DA分析提取得到6個主成分,其代表97% X變量和97.6% Y變量變化,該模型擁有97.3%的預測能力。圖3是顯示了在X變量空間內的至模型距離,反映了不同干燥處理黃花菜在Y變量的擬合效果,由圖3可知,1、14、15、19、31、32、33、35和90號樣品測定的結果超出了95%的置信范圍,其余各個樣品皆在范圍內。表明該方法可對不同干燥處理黃花菜FIMS指紋圖譜進行有效的分析。

圖3 不同干燥處理黃花菜PLS-DA的至模型距離Fig.3 PLS-DA of distance to model X plot FIMS fingerprints for treatment of daylily

圖4是負離子模式下不同干燥處理黃花菜PLS-DA在二維平面上的得分圖。不同處理樣品的區分效果較好,3個干燥處理90個黃花菜的數據點均位于95%置信區間內,同時不同處理的樣品分別集中于圖的3個不同區域。由圖4可以看出,不同干燥處理的黃花菜分別位于不同的象限區域,其中編號為1～30的真空冷凍干燥樣品分布于得分圖的右下方,位于第4象限;編號為31～60的自然干燥樣品分布于得分圖的左下方,位于第3象限;編號為61～90的熱風干燥樣品分布于得分圖的上部,位于第1和2象限之間。

圖4 不同干燥處理黃花菜的PLS-DA得分圖Fig.4 PLS-DA scores plot for treatment of daylily

從負離子模式下不同干燥處理黃花菜的PLS-DA結果可以看出,與PCA分析相比,不同干燥處理的樣品分布位置略有不同,但數據集分布的更為集中,通過組間數據的差異最大化以及組內數據的差異最小化,不同處理后的黃花菜樣品由于化學成分的差異,得到了更好地分類(組間)與聚集(組內)。通過該數據處理方法可以快速、客觀地分析不同干燥處理黃花菜化學成分的差異及其組別。

2.4 化學標記物篩選及分析

通過PLS-DA可以看出,干燥處理后含有相似化學成分或化學成分含量相近的黃花菜樣本被聚為一類,各組內樣本點聚集較好,而含有不同化學成分或化學成分含量相差較大的樣本在得分圖上離得較遠。為了分析在分類中起決定性作用的化學標記物,通過載荷圖對數據進行了進一步分析,見圖5。

圖5 不同干燥處理黃花菜的PLS-DA載荷圖Fig.5 PLS-DA loading plot for treatment of daylily

圖5是負離子模式下不同干燥處理黃花菜PLS-DA得到的二維載荷圖,該圖反映了各變量對不同干燥處理樣本分布的影響。在因子載荷圖上,每一個變量都體現出了其對樣品在得分圖上分布的貢獻,離密集區越遠的變量對樣品分類影響越大。在本實驗中,變量就是不同干燥黃花菜提取物直接進樣而得到的離子,其對樣品分類的貢獻可以通過在因子載荷圖上的位置來判斷[13]。那些在因子載荷圖上比較分散的離子對樣品分類的貢獻比較大,稱之為特征離子。由圖5可知,真空冷凍干燥的黃花菜樣品中m/z 191、243、421和609 4個離子強度較高,故分布在PC1正方向;自然干燥的黃花菜樣品中m/z 665和503離子強度較高;熱風干燥的黃花菜樣品中m/z 341離子強度較高,說明了正是這些成分造成了不同干燥黃花菜樣品質量之間的差異。VIP圖可顯示模型中因素的重要性,從中篩選出VIP值>1的成分確定為貢獻較大的成分。由圖6可見,VIP值由大到小排序,VIP值>1的有26個特征離子,是造成不同干燥處理黃花菜差異性的貢獻較大的特征離子,其中m/z 503、191、421、243、609、665 6個貢獻最大,可以作為化學標記物研究不同干燥方式黃花菜的質量差別。

圖6 PLS-DA VIP值圖Fig.6 PLS-DA VIP plot for treatment of daylily

3 結論

本研究首次運用FIMS對不同干燥處理的黃花菜進行了分析。

采用PCA和PLS-DA這兩種化學計量學方法建立了數據分析模型,PCA和PLS-DA模型均能對不同處理的黃花菜樣品進行有效分類,但PCA處理后3個主成分的貢獻率是91.2%,PLS-DA的分類模型預測能力達到97.3%,因此選擇更優的PLS-DA模型,可以較全面的反映數據信息,而且具有較高的預測能力。因此,該方法作為一種極具特點的指紋圖譜分析技術,可以用于不同加工方式對農產品質量的快速判別研究。