超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物組織中 10種抗膽堿類藥物殘留方法建立

劉洪斌,姚喜梅,張 鷺,李 穎,姜艷彬,蔡英華,*

(1.中國動物疫病預防控制中心,北京 102609; 2.中國標準化協會,北京 100048)

抗膽堿類藥物臨床主要用于解痙止痛、松弛肌肉和治療重癥高血壓病等[1-2],但同時也存在口干,心跳過速和尿潴留的副作用,如果過量使用會出現煩躁不安、痙攣等神經興奮癥狀,進而造成昏迷、呼吸困難或者死亡[3-4]。隨著畜牧養殖業的高速發展,部分抗膽堿藥物也被允許用于治療動物疾病,促進動物生長,但不合理用藥造成的藥物殘留對消費者造成極大的安全隱患,同時該類藥物存在口干和尿潴留的副作用變相促使動物多飲水,保水抗利尿以達到動物異常增重的效果[5],這為不法分子通過非法向動物體內注水,借助藥物保水抗利尿功能,達到動物增重的目的提供了可能。但目前還未見通過檢測動物體內具有此類功能藥物異常含量來監控藥濫用和指示注水可能的報道,因此建立動物組織中抗膽堿類藥物確證檢測方法對打擊非法藥物添加和注水意義重大。

目前抗膽堿類藥物的研究多見于醫學研究領域[6-9],主要研究內容為該類藥物對人體及動物的治療效果及藥物作用機理研究;主要檢測方法包括液相色譜法[10-11]、液質或氣質聯用法[12-15]、飛行時間質譜法[16]和電化學方法[17]等,而該類藥物在動物組織中殘留檢測方法的報道較少[18],多殘留同時檢測還未見報道,因此本文建立動物組織中10種抗膽堿類藥物殘留液質串聯檢測方法,該方法操作簡單,耗時少,靈敏度高,穩定性好,較好的滿足動物組織中抗膽堿藥物殘留檢測需求,對更好地防范和監管動物源性食品藥物殘留和非法添加具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉、豬肝 購于農貿市場,經LC-MS/MS分析確認為陰性樣本;鹽酸丙哌維林(cas:54556-98-8)、鹽酸貝那替嗪(cas:57-37-4)、氫溴酸后馬托品(cas:51-56-9)、鹽酸哌侖西平(cas:29866-97-1)、鹽酸雙環胺(cas:67-92-5)、氫溴酸東莨菪堿(cas:6533-68-2)、托吡卡胺(cas:1508-75-4)、硫酸阿托品(cas:55-48-1)、丁溴酸東莨菪堿(cas:149-64-4)、美卡拉明(cas:60-40-2) 購于美侖生物技術公司,純度均在97%以上;乙腈、甲醇、甲酸等有機溶劑 均為色譜純,購自美國Fisher公司;用甲醇將上述標準品配制單標母液(已折扣鹽酸鹽、硫酸鹽及純度),并配制10 μg/mL混合儲備液于-20 ℃保存,使用時現配成系列標準工作液;GHP膜 美國Waters公司;PTFE膜 Agilent公司;津騰尼龍膜和聚醚砜膜 天津津騰實驗設備有限公司。

Waters Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg,3 mL)、超高效液相色譜儀(Acquity UPLC I-CLASS)配三重四極桿質譜儀(TQ-XS) 美國Waters公司;3K15型離心機 美國Sigma公司;均質機 德國IKA公司;N-EVAP氮吹儀 美國Organomation公司:純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理過程

1.2.1.1 提取 準確稱取勻漿好的2 g(精確到0.01 g)動物組織樣品(豬肉、豬肝)于50 mL離心管中,加入10 mL 1.0%甲酸乙腈,9500 r/min離心5 min取上清液于另一50 mL離心管中,再用10 mL 1.0%甲酸乙腈重復提取一次,合并兩次提取液,待過凈化柱。

1.2.1.2 凈化 將提取液全部加入事先用3 mL 1.0%甲酸乙腈活化的Oasis PRiME HLB柱中,流速1 d/s左右,收集全部濾過液,50 ℃氮氣吹至近干,1 mL初始流動相定容,12000 r/min離心5 min,0.22 μm尼龍濾膜過濾待上機測定。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速:0.3 mL/min;流動相A:0.1%甲酸水溶液,B:甲醇,0～0.5 min,95% A保持不變,0.5～2.0 min,95% A線性變化至75%;2.0～3.5 min,75% A保持不變,3.5～3.6 min,75% A線性變化至60%,3.6～4.0 min,60% A保持不變,4.0～6.0 min,60% A線性變化至0%,6.0～8.0 min,0% A保持不變,8.0～8.5 min,0% A線性變化至95%;8.5～10.5 min,95% A保持不變;進樣量10 μL。

1.2.3 質譜條件 電離模式:ESI+;毛細管電壓:3.0 kV;萃取錐孔電壓:3 V;RF透鏡電壓:0.5 V;源溫:150 ℃;脫溶劑溫度:250 ℃;錐孔氣流速:150 L/h;脫溶劑氣流速:600 L/h;碰撞氣流速:0.15 mL/min;采集模式:MRM;各種藥物優化母離子和子離子及對應聚焦電壓和碰撞電壓值見表1。

表1 抗膽堿類藥物檢測離子、對應質譜參數及保留時間Table 1 Qualitative ions,quantitative ions and relevant parameters of anticholinergic drugs

1.2.4 不同過濾膜選擇實驗 過濾步驟在前處理過程中起著減少雜質,降低基質效應的重要作用,因此濾膜種類與藥物的吸附程度對檢測方法的準確性影響甚大,本文考察了4種不同廠家、型號濾膜對20 μg/L混合標準溶液的吸附影響,試驗選取Waters GHP膜、Agilent PTFE膜以及津騰尼龍膜、聚醚砜膜等4種適用于絕大多數有機溶劑和水溶液的濾膜,實驗結果采用吸附率衡量濾膜的適用性。吸附率(%)=(C未過膜-C過膜)/C未過膜×100,其中C表示上機濃度。

1.2.5 提取溶劑優化實驗 已知抗膽堿類藥物檢測方法多為醫學領域,基質多為血漿[12-15]、尿液[16]、藥品制劑[11,19]等,動物組織中前處理方法少見報道[18],鑒于動物組織的復雜性,本文通過空白豬肝樣品添加10 μg/kg 10種抗膽堿類藥物混標溶液,分別選取甲醇、乙腈、80%乙腈水(V乙腈∶V水=8∶2)、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈等7類提取溶劑處理樣品,通過提取回收率確定最佳提取溶劑?；厥章?%)=C提取后/C添加濃度×100,其中C表示濃度。

1.2.6 基質效應實驗 動物組織成分較為復雜,脂類、可溶性蛋白或肽類及其代謝產物等各種有機物[20-21]經前處理過程后,仍有部分會保留在待測樣品溶液中,以共流出物形式和待測藥物同時進入電離源時,對待測藥物離子化過程產生嚴重干擾,從而產生抑制或增強的效果。實驗采用提取后添加法[22]來判斷基質效應的影響,實驗按照1.2.1方法處理組織樣本(豬肉、豬肝),然后添加10 μg/kg混合標準溶液制成基質加標溶液,與溶劑加標溶液進行比較,基質效應(ME)=標液在空白動物組織中峰面積/標液在純溶劑中峰面積,若比值小于1.0,說明基質對待測物的響應產生抑制作用;若大于1.0,說明基質的存在增強效果;若等于1.0,說明待測物的響應未受影響。

1.2.7 線性方程及靈敏度 實驗實驗采用空白組織樣品經1.2.1方法處理,在1.0～50.0 μg/L濃度范圍內分別添加10種抗膽堿類藥物混標溶液,配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L基質加標溶液,經UPLC-MS/MS檢測,以定量離子色譜峰面積為縱坐標,待測藥物濃度為橫坐標做標準曲線,將處理好的空白組織樣品逐級稀釋標準溶液,按3倍信噪比確定方法檢出限(LOD),10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。

1.2.8 回收率實驗 取空白豬肉、豬肝樣品,添加濃度為1.0、2.0、10 μg/kg 3個水平混標溶液,批內6次平行,不同時間重復測定3個批次,按1.2.1方法進行添加回收實驗;同時通過空白樣品與添加樣品總離子圖比較該方法的專屬性。

1.2.9 實際樣品檢測 本實驗對從超市及農貿市場共抽檢豬肉、豬肝樣品30份進行測定,并隨樣進行盲樣添加試驗,對方法的準確性和適用性再次進行驗證。

1.3 數據處理

MassLynxTM4.2數據采集分析軟件。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

由于抗膽堿類藥物具有哌啶環,含氮雜環或具有氨基結構,因此采用正離子模式采集數據,將濃度為0.5 mg/L的抗膽堿類藥物以單標樣流動泵直接進樣方式采集[M+H]+準分子離子峰,在一定碰撞電壓下,對其[M+H]+進行二級質譜掃描,得到定性和定量碎片離子信息,并對碰撞氣能量、電噴霧電壓、霧化氣、源溫等質譜參數進行優化,具體參數見表1。

針對多種類藥物殘留檢測,梯度洗脫能較好的實現各種藥物的有效分離,本實驗采用從高水相到高有機相比例漸進的洗脫方式,既能保證不同極性差異的藥物在不同保留時間的良好分離,又能充分洗脫掉組織基質中不同極性雜質,配合儀器溶劑延遲功能,極大的降低了待測樣品對色譜柱和進樣錐孔的污染。

2.2 不同過濾膜對藥物吸附率的影響

由圖1可知,顯示4種濾膜對美卡拉明、氫溴酸東莨菪堿、雙環胺、貝那替嗪、哌侖西平、丁溴酸東莨菪堿等六種物質存在不同程度吸附作用(見圖1),吸附率在0.7%～68.7%之間;其中Waters GHP膜、Agilent PTFE膜對雙環胺吸附明顯,吸附率分別為36.3%和68.7%,綜合各藥物吸附率及性價比考慮,實驗選取尼龍膜作為過濾膜,但考慮到尼龍膜對部分藥物也存在吸附作用,因此，為減少濾膜吸附對實驗結果造成的影響,標準溶液也需經濾膜過濾后上機。

圖1 不同濾膜過濾條件下吸附率對比圖Fig.1 Adsorption rate were obtained by different filtration conditions

2.3 提取溶劑選擇

由圖2可知,當甲醇為提取劑時,蛋白變性沉淀不完全,樣品整體較為渾濁,雜質干擾較大;10種藥物在甲醇、80%乙腈水中回收率低于乙腈和酸性乙腈提取劑,除雙環胺、丙哌維林外,其他藥物在乙腈及酸性乙腈中回收率差異不明顯,而雙環胺、丙哌維林和乙腈中甲酸含量成正比,當甲酸含量達到1.0%時,兩種藥物的回收率能達到60%以上,原因主要為酸性條件有助于該類藥物在提取溶劑的溶解,因此實驗最終提取溶劑選擇為1.0%甲酸乙腈。

圖2 不同提取條件下回收率Fig.2 Recoveries were obtained by different extraction methods

2.4 基質效應

由圖3可知,除豬肉中哌侖西平、豬肝中丁溴酸東莨菪堿抑制效果不明顯外,其它種類藥物在兩種基質中均存在不同程度抑制效果,ME在0.37～0.98之間,其中豬肝基質比豬肉樣本抑制作用更為嚴重,因此為減少基質效應帶來的影響,應在實際檢測中采用空白基質加標溶液。不同藥物基質抑制程度見圖3。

圖3 基質效應圖Fig.3 Figure of matrix effect in animal matrix

2.5 線性方程及靈敏度實驗

實驗結果表明在豬肉、豬肝組織中,10種抗膽堿類藥物均在1.0～50.0μg/L范圍內線性良好,線性系數均大于0.9951,10種抗膽堿類藥物的方法定量限均低于1.0 μg/kg。因豬肝基質干擾較大,標準曲線及靈敏度略低于豬肉中。因此，以豬肝組織為例,10種抗膽堿類藥物線性方程、相關系數、檢出限和定量限等參數見表2。

表2 豬肝中10種抗膽堿類藥物線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,detection limits,and quantification limits of ten anticholinergic drugs in liver

2.6 回收率實驗

由表3可知,豬肉中平均回收率在64.7%～108.2%,批內變異系數為1.09%～10.5%,批間變異系數為2.31%～11.4%,豬肝中平均回收率在62.6%～108.0%,批內變異系數為0.38%～10.7%,批間變異系數為2.24%～11.2%,方法的準確度及精密度滿足 GB/T 27404-2008[23]技術要求,結果見表3。

表3 動物組織中10種抗膽堿類藥物添加回收率、RSD值(n=6)。Table 3 Spiked recoveries,RSDsof ten anticholinergic drugs in animal matrix(n=6)

同時由圖4、圖5可以看出空白基質中待測藥物應出峰位置處并不存在干擾峰,進一步說明該方法專屬性較強。空白樣品與添加樣品總離子圖(以豬肝樣本為例)見圖4、圖5。

圖4 空白豬肝樣品選擇離子圖Fig.4 MRM chromatograms of the blankliver

圖5 空白豬肝基質中添加10 μg/kg10種抗膽堿類藥物選擇離子圖Fig.5 Chromatograms obtained from blank liver spiked with10 μg/kg of ten anticholinergic drugs

2.7 實際樣品檢測

本實驗對從超市及農貿市場共抽檢豬肉、豬肝樣品30份進行測定,并隨樣進行盲樣添加試驗,最終從抽檢的50份樣本中未檢出上述10種抗膽堿類藥物,而隨測盲樣檢出阿托品及貝那替秦分別為4.32 μg/kg和3.87 μg/kg(添加量均為5.0 μg/kg),回收率分別為86.4%和77.4%,進一步證實該方法適用于動物組織中10種抗膽堿類藥物檢測。

3 結論

本實驗建立了一種針對動物組織中多種抗膽堿類藥物殘留檢測方法,通過優化液相、質譜參數,優化前處理方法,最終建立了動物組織中10種抗膽堿類藥物UPLC-MS/MS檢測方法,并通過方法學驗證。該方法操作簡單快捷,靈敏度較高,穩定性較好的特點,能夠較好滿足動物組織中該類藥物殘留檢測要求,鑒于目前還未見相關藥物在動物產品中多殘留檢測報道,該方法的建立能有效防范藥物濫用和非法添加行為,并對打擊注水肉提供一定的技術支撐。