南瓜谷氨酸脫羧酶酶學特性 及γ-氨基丁酸富集條件

舒成亮,王春茹,郭曉風,單勝艷,薛玉清,歐 凱,李言郡

(杭州娃哈哈集團有限公司,浙江省食品生物工程重點實驗室,浙江杭州 310018)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛存在于動植物和微生物體內的非蛋白質氨基酸,作為高等動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質,參與多種代謝活動,具有重要的生理活性。大量研究表明,GABA具有降低血壓,治療癲癇,鎮靜安神,調節激素分泌,增強記憶,控制哮喘等多種生理功能[1-3]。目前,GABA的制備方法主要有化學合成和生物制備兩類方法,前者由于強腐蝕性試劑的使用,反應條件劇烈,得率低等因素難以用于食品加工領域,而生物法包含植物富集法和微生物發酵法,是目前GABA制備的主要方法[4]。微生物發酵法不受資源環境限制,十分契合現代工業集約化生產的需求,但也存在高產菌株難篩選易退化,生產周期長,發酵微生物在食品領域受限的問題。植物富集法簡單易行,資源可再生,產物可直接作為食品原料,具備天然優勢。鑒于此,植物富集GABA的方法受到國內外學者的廣泛關注和深入研究。茶葉[5]、桑葉[6]、谷物胚芽[7-9]、辣椒、茄子等植物是GABA富集研究的主要素材,通過厭氧[9]、浸泡[10]、酶解[8]、低溫脅迫[9]、超聲波[10]等處理方式,達到富集GABA的目的。但由于GABA在植物體內含量較低,且需要較強的外界刺激,通常GABA富集濃度不高,且工藝復雜,規模化生產可行性不高。南瓜作為價廉易得的大宗農產品,已有研究報道其含有較高GAD活力[11],然而,利用南瓜進行GABA富集在國內外幾乎處于空白狀態。中國市售食用南瓜從生物學角度劃分主要有兩類,中國南瓜(Cucurbitamoschata)和日本南瓜(Cucurbitamaxima),針對兩類南瓜的GAD活力和GABA富集能力尚未見文獻報道。為此,本研究以兩類南瓜為原料,通過研究南瓜GAD活性、GABA富集適宜條件及工藝,為探索GABA高效生產方法提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮南瓜 中國南瓜A產自浙江,中國南瓜B產自湖北,日本南瓜C產自浙江,日本南瓜D產自山東;味精 含一水谷氨酸鈉99%，市售;磷酸氫二鈉、檸檬酸等 均為分析純;GABA標準品 AN型(P/N G370380)和B型生理體液氨基酸標準溶液(P/N G370381),日本和光試劑公司。

Beckman Coulter Avanti J-26 XP臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司;全自動氨基酸分析儀L-8900 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜中GAD酶活力測定 將中國南瓜A(下文中未標明南瓜類別均為中國南瓜A)與0.2 mol/L,pH5.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(下文所述緩沖液同上)按1∶1的比例混勻后打漿,制成粗酶液,取10 g粗酶液加入味精0.5 g,加入緩沖液定容至50 mL,充分混勻,40 ℃反應1 h后于95 ℃ 10 min滅酶,10000 r/min,25 ℃離心10 min,取上清液,測定GABA含量并計算GAD活力。GAD活力定義:每分鐘催化反應產生1 μmol GABA所需的酶量定義為1個單位活力U。計算公式如下:

式中,c為GABA的質量濃度(g/mL),V為反應液體積(mL),M為GABA的摩爾質量(g/mol),t為反應時間(min),106為mol轉化為μmol的系數。

1.2.2 南瓜GAD酶學特性研究 為明確GABA富集過程中最關鍵的因素-南瓜GAD的特性,同時探明實際生產中南瓜原料的儲運和加工條件對南瓜GAD活力的影響,開展以下南瓜GAD酶學特性研究。實驗均重復三次,取平均值。

1.2.2.1 南瓜GAD最適反應溫度 按1.2.1中所述的方法分別在20、30、35、40、55、70 ℃下測定南瓜GAD活力,確定南瓜GAD最適溫度。

1.2.2.2 南瓜GAD最適反應pH 分別配制0.2 mol/L,pH為4.0、4.6、5.0、5.4、5.8、6.4和7.0的緩沖液構建反應體系,按1.2.1中所述的方法測定南瓜漿中GAD在各自pH下的活力,確定最適pH。

1.2.2.3 南瓜GAD的熱穩定性 考察不同溫度下熱處理30 min后南瓜GAD活力的損失情況。以料水比為1∶1制備的南瓜漿作為粗酶液,分別于40、50、60、70、80、90 ℃下水浴保溫30 min,保溫結束后立即冷卻至25 ℃,測定GAD活力及活力損失率。以不經水浴保溫的南瓜漿為對照,比較在南瓜GAD活力在熱處理后的損失情況。

1.2.2.4 南瓜GAD的冷凍穩定性 考察冷凍數周時間后南瓜GAD酶活力的損失情況。以料水比為1∶1制備的南瓜漿作為粗酶液,將其于零下20 ℃冷凍保存,分別于第0、1、2、3、4、6、8周取出,于25 ℃解凍3 h,25 ℃測定GAD活力并計算GAD活力損失率。以不經冷凍的南瓜漿為對照,考察南瓜GAD經不同時間冷凍后的酶活力穩定性。活力損失率計算公式如下:

式中,A1為未經熱處理(或冷凍)的南瓜GAD活力,A2為經熱處理(或冷凍)后的南瓜GAD活力。

1.2.3 南瓜預處理及GABA富集 選擇外觀無損傷無腐敗的南瓜,洗凈并使用50 mg/L次氯酸鈉溶液消毒30 min,純凈水沖洗干凈,切成1～3 cm的小塊,將無菌水或經滅菌處理的與南瓜按一定比例混合,采用膠體磨打漿3次,確保南瓜被充分破碎。打漿后將味精加入至反應體系中,在合適的溫度、pH等條件下靜置反應一段時間進行GABA富集,反應結束后,將反應液于10000 r/min,25 ℃離心10 min,收集上清液,測定GABA及L-谷氨酸(L-Glu)含量。

1.2.4 南瓜富集GABA最佳反應條件實驗設計 考察反應時間、南瓜品種、反應體系、南瓜添加量、味精添加量、料水比等參數對GABA富集的影響,每個實驗方案均重復三次,取平均值。

1.2.4.1 反應時間對南瓜富集GABA的影響 將南瓜與0.2 mol/L,pH5.8的緩沖液按質量比1∶1的比例混勻打漿,制得50%南瓜漿,實驗反應體系中南瓜漿40%(w/w),味精1.5%(w/w),30 ℃靜置反應,選擇0、1、2、4、6、8、18、24 h 8個時間點取樣測定GABA及谷氨酸含量。

1.2.4.2 南瓜品種及反應體系對GABA富集的影響 比較中國南瓜A、中國南瓜B、日本南瓜C和日本南瓜D富集GABA能力的差異;同時,為考察緩沖體系在南瓜富集GABA中的實際效果,分別在純水體系及緩沖液體系中進行GABA富集實驗。選取四種南瓜為原料,分別與0.2 mol/L,pH5.8緩沖液和純水按1∶1的比例混合打漿,反應體系中南瓜漿40%(w/w),味精1.5%(w/w),30 ℃靜置反應18 h。比較緩沖液體系與純水體系下GABA富集量,同時比較四種南瓜在兩種體系下的GABA富集能力。

1.2.4.3 南瓜及味精添加量對GABA富集的影響 將南瓜與緩沖液按1∶1打漿后制成南瓜漿,分別按40%,60%和80%(w/w)的比例添加至反應體系中,底物味精添加量分別為1.0%和1.5%(w/w),于30 ℃靜置反應18 h,考察南瓜及味精添加量對GABA富集的影響。

1.2.4.4 打漿料水比對南瓜富集GABA的影響 將南瓜與0.2 mol/L,pH5.8的緩沖液分別按1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5及1∶3的比例打漿,添加量均為25%(w/w,以南瓜重量計),味精添加量為1.5%(w/w),溫度30 ℃,靜置反應18 h,考察打漿料水比對GABA富集的影響。

1.2.5 GABA及L-Glu含量測定 取1.2.1或1.2.3所述上清液,經0.22 μm濾膜過濾,采用氨基酸分析儀進行GABA和L-Glu含量測定。

1.2.6 GABA轉化率及GABA富集量計算 GABA轉化率定義為GABA實際生成量與理論上谷氨酸鈉全部轉化為GABA的生成量的比值。GABA富集量定義為單位質量(g)南瓜生成GABA的量(mg)。

1.3 數據分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件，以Duncan多重比較對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 南瓜GAD酶學特性研究

2.1.1 南瓜GAD最適溫度 由圖1可知,南瓜GAD在30～35 ℃酶活力最高,在溫度20和40 ℃時,GAD活力亦比較高,與最高活力(30 ℃)相比無顯著性差異(p>0.05),當溫度超過55 ℃時,酶活力有明顯的降低(p<0.05)。后續實驗選擇30 ℃為反應溫度。

圖1 溫度對南瓜GAD活力的影響Fig.1 Effects of temperature on pumpkin GAD activity

2.1.2 南瓜GAD最適pH考察 由圖2可知,在所選pH范圍內,5.8是南瓜GAD最適pH,在該pH下,酶活力最高,同時,酶活力隨pH升高呈先增加后降低的趨勢,相比于pH在5.0～6.4時，當pH低于5.0或高于6.4時,酶活力顯著降低(p<0.05)。本實驗得出的結論與Matsumoto等[11]對南瓜的研究結果一致,Brandon等[12]和呂瑩果等[13]分別對豇豆和米胚芽GAD酶學性質進行研究,兩種植物GAD的最適pH分別為5.5～6.0和5.6,與南瓜GAD最適pH近似,而劉清等[14]的研究結果表明,乳酸菌GAD最適pH為4.5,與本文結果差別較大。后續實驗選擇的pH為5.8。

圖2 pH對南瓜GAD活力的影響Fig.2 Effects of pH on pumpkin GAD activity

2.1.3 南瓜GAD熱穩定性 由圖3可知,南瓜GAD活力隨保溫溫度的升高而逐漸下降,損失率逐漸增加,40 ℃保溫30 min后南瓜GAD酶活力幾乎沒有損失,當超過70 ℃進行保溫時,南瓜GAD酶活力幾乎完全喪失。呂瑩果等[13]研究發現米胚GAD的熱穩定較差,80 ℃時酶幾乎完全失,結果與本實驗相符。

圖3 熱處理對南瓜GAD活力的影響Fig.3 Effects of thermal treatments on pumpkin GAD activity

2.1.4 南瓜GAD冷凍穩定性 由圖4可知,冷凍時間在4周以內時,南瓜GAD活力損失率很低(≤10%),冷凍6周以上酶活力損失率逐漸增加,當冷凍時間為8周時,酶活力損失率為36%。

圖4 冷凍對南瓜GAD活力的影響Fig.4 Effects of freezing on pumpkin GAD activity

2.2 南瓜富集GABA最佳反應條件的探索

2.2.1 反應時間對南瓜富集GABA的影響 由圖5可知,在最初的1 h內,谷氨酸含量急劇下降,同時GABA含量急劇上升,隨著時間延長,GABA生成的速率逐漸減緩,反應前4 h生成的GABA含量遠高于后20 h,由此可見,在反應前期如何促進GABA含量提高是整個反應的關鍵環節。經過18 h反應后,反應液中GABA濃度為5267.4 mg/L,換算為單位質量南瓜的GABA富集量為26 mg/g,繼續延長反應時間,GABA富集量無顯著性增加。與文獻中利用玉米胚[7]、米糠[15]、茶葉[5]等作為原料進行GABA富集相比,本研究利用生鮮南瓜可富集更高含量的GABA。后續實驗反應時間控制在18 h。

圖5 反應時間對GABA濃度的影響Fig.5 Effects of reaction time on GABA concentration

2.2.2 南瓜品種及反應體系對GABA富集的影響 由圖6可知,無論在純水體系還是緩沖液體系下,中國南瓜富集GABA的能力均強于日本南瓜,且產自兩個區域的中國南瓜富集GABA能力十分接近,對于日本南瓜亦是如此,可以推斷,南瓜的品種對所含GAD酶活力影響比較大,從而影響GABA富集能力。而對于同種南瓜,產地的影響并不大。考慮到后續放大生產中南瓜原料的篩選是核心環節,本實驗為南瓜的篩選提供重要參考。后續實驗均采用中國南瓜A作為實驗原料。

圖6 南瓜品種及反應體系對GABA富集的影響Fig.6 Effects of pumpkin varieties and reaction solutions on GABA accumulation

緩沖液體系下進行反應GABA富集量顯著高于純水體系(p<0.05),主要原因在于GABA由谷氨酸分子脫去一個羧基后形成,此過程需要消耗H+,在純水體系中,隨著反應進行,反應液pH會逐漸升高,較高的pH偏離了GAD最佳反應pH,同時帶來微生物污染的風險;而在緩沖液體系中,pH的升高得到有效抑制,從而確保反應在合適的環境中繼續進行,提高GABA濃度。從更廣義的角度說,GABA富集的過程是一個酶反應,包括GAD在內的所有生物酶,在緩沖液中更有利于酶蛋白分子天然構象的保持和活性的發揮。后續實驗均選擇在緩沖液中開展。

2.2.3 南瓜及味精添加量對GABA富集的影響 由表1結果可知,當味精添加量為1.0%時,不同南瓜漿比例方案GABA濃度、富集量和轉化率均有顯著性差異(p<0.05),其中南瓜漿比例為40%時,雖GABA富集量較高,但反應液中GABA濃度較低,轉化率為90.6%,當南瓜漿比例為60%時,GABA濃度可達5384 mg/L,轉化率達到98.7%,由于南瓜漿添加量高,單位質量的南瓜GABA富集量相對減少。當味精添加量為1.5%時,南瓜漿添加比例越高,GABA濃度和轉化率越高,添加南瓜漿比例為80%時,GABA濃度可達7647 mg/L,轉化率達到93.5%,相比40%和60%具有顯著性差異,南瓜漿添加量為40%時,單位質量南瓜GABA富集量最高,但與60%相比并不顯著。總之,味精添加量較低時,可選擇相對較低的南瓜漿比例,味精添加量較高時,南瓜漿添加比例應適當提高。味精的有效成分谷氨酸鈉是GABA前體物質谷氨酸的鈉鹽,是GAD的底物,對GABA富集量有重大影響,有研究人員進行GABA富集時不額外添加谷氨酸或其鈉鹽,富集后GABA含量一般僅提高數倍[10],而添加底物則可將GABA含量提高數十倍乃至上百倍[7]。綜合考慮,選擇南瓜漿40%,味精1.5%作為后續實驗條件。

表1 南瓜漿及味精添加量對GABA富集的影響Table 1 Effects of pumpkin syrup and MSG concentration on GABA accumulation

2.2.4 打漿料水比對南瓜富集GABA的影響 由表2結果可知,打漿所用緩沖液比例越高,反應最終獲得的GABA濃度越高,相應的,GABA富集量和轉化率越高,不同料水比之間,1∶1和1∶3與其他比例之間具有顯著性差異,而1∶1.5,1∶2和1∶2.5之間差異不顯著。主要原因在于緩沖液比例越高,采用膠體磨打漿時越易將南瓜細胞破碎,促進酶的溶出,進而促進谷氨酸轉化為GABA。當料水比為1∶3,且其他參數均選擇最佳條件時,GABA富集量達到30.5 mg/g,與未富集時相比(0.23 mg/g)提高了132倍。研究表明,GAD和GABA參與植物應激反應[16],機械壓力刺激有助于GABA 的富集，因此本實驗中膠體磨提供的機械壓力是GABA 富集的動力。此外，本實驗室還對底物味精添加順序進行了初步研究，預先加入至緩沖液中再與南瓜混合打漿比打漿后加入更有利于GABA 富集( 數據未顯示) ，驗證了底物在應激反應發生后盡快與GAD 接觸有助于GABA 富集。

表2 料水比對南瓜富集GABA的影響Table 2 Effects of pumpkin buffer ratio on GABA accumulation

3 結論

對南瓜GAD最適反應溫度、最適pH、熱穩定性和冷凍穩定性等酶學特性進行研究,南瓜GAD最適反應溫度為30～35 ℃,最適pH為5.8;南瓜GAD對熱比較敏感,超過50 ℃短時間保溫即可導致酶活力快速喪失。冷凍對GAD影響相對較小,但長期冷凍仍會導致酶活力損失。利用南瓜GAD進行GABA富集,探索了反應時間、南瓜品種、緩沖體系、南瓜及味精添加量、料水比對富集效果的影響。選擇pH5.8,0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液作為反應溶液,南瓜與緩沖液的打漿比例為1∶3,南瓜添加量為25%,底物味精添加量為1.5%,30 ℃靜置反應18 h,反應液中GABA濃度可達7633.2 mg/L,轉化率為93.3%,單位質量南瓜GABA富集量為30.5 mg/g,與未富集時相比提高了132倍。通過減少南瓜或味精添加量可達到提高單位GABA富集量(最高為33.5 mg/g)或轉化率(最高為98.7%)的目的,但要以犧牲總GABA濃度為前提,并不是最經濟的方案。本研究對南瓜富集GABA的相關工藝條件及南瓜GAD酶學特性進行了初探,為植物富集GABA提供了一條新的路徑,然而,該項工作仍面臨一些尚未解決的難題,如何確保工業化生產時南瓜內源酶活力的一致性、如何防止反應過程中微生物污染、如何確保GABA濃度的同時減少味精殘留、提升口感都需要進一步的深入研究。