老山芹降血糖功能成分提取及活性研究

趙玉紅,李佳啟,馬 捷,王 路

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱150040; 2.哈爾濱工業大學化工學院,黑龍江哈爾濱150090)

糖尿病作為一種慢性綜合代謝疾病發病率逐年升高,其特征是慢性高血糖和絕對或相對缺乏胰島素[1],長期患糖尿病易引起白內障[2]、貧血[3]、中風[4]及心血管疾病[5]等并發癥,危及生命,嚴格的血糖控制則可以降低此類風險的發生[6]。為適應現代人的生活需求和拓展糖尿病治療的新型方式,以食源性原料提取降血糖功能成分對糖尿病的治療具有重要意義。現研究降血糖效果一般可通過α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的體外檢測[7-8]和飼養、分析小鼠的體內檢測[9-10]進行。周愛玉[11]對藏藥綠蘿花進行研究,得出綠蘿花提取物對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度為0.267 mg/mL。王會[12]通過對香蕉花進行研究,得出香蕉花提取物對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度為0.788 mg/mL。尚禹東等[13]通過研究銀杏葉,得出銀杏葉提取物對蔗糖酶的半數抑制濃度為0.758 mg/mL,α-淀粉酶的半數抑制濃度為0.910 mg/mL。本文通過對老山芹提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的半數抑制濃度的測定,研究老山芹的降血糖效果。

老山芹,學名東北牛防風,別名短毛白芷、土當歸、山芹菜等,為分布于我國新疆、黑龍江和吉林等地的傘形科獨活屬多年生草本植物[14],在朝鮮、俄羅斯等國山地混雜林緣、灌木叢中、山坡草地等處也有分布,是一種兼備食用和藥用保健價值的春季山林野生蔬菜,被譽為山野菜中的“綠色黃金”。具有扶正固本、強健身體、抗疲勞等功能,尤其對風濕、類風濕、高血糖等疾病的痊愈具有顯著的食療效果。全株可入藥,味甘辛,性涼,具備清熱解毒,凈化血液,降低血糖和血壓的效用[15]。國內外對老山芹的研究集中在對老山芹的培養方式以及化學成分的研究[16-19],缺乏老山芹降血糖作用及成分的研究。

本文以老山芹為原料,以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率為評價指標,采用超聲波輔助提取法,以不同濃度的乙醇溶液、甲醇和乙酸乙酯進行提取,確定適宜的提取溶劑,運用響應面優化法對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有抑制效果的成分的提取條件進行優化。為提高老山芹深加工利用水平和將老山芹應用于降血糖方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老山芹粉末(新鮮老山芹于50 ℃烘箱中烘干后,粉碎過80目篩) 吉林白山;α-葡萄糖苷酶(70萬 U/mL) 上海源葉生物科技有限公司;α-淀粉酶(4000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(生物技術級) 上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、碳酸鈉 國產分析純,天津市天力化學試劑有限公司。

YP-2002型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司;DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒儀器有限責任公司;TDL-40B-W型臺式低速大容量離心機 上海星科科學儀器有限公司;RE-2000A型旋轉蒸發器 鞏義市予華儀器有限責任公司;RT-6000型酶標儀 深圳雷杜生命科學有限公司;KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;SHZ-DⅢ型予華牌循環水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑的篩選 準確稱取7份老山芹粉末各3 g于燒瓶中,超聲功率210 W,超聲溫度50 ℃,超聲時間120 min,料液比1∶15 (g/mL),分別加入20%、40%、60%、80%的乙醇溶液以及無水乙醇、甲醇和乙酸乙酯進行提取,于4000 r/min離心機中離心10 min,取上清液過濾,在50 ℃旋轉蒸發儀中減壓濃縮。平行3組實驗,考察不同提取溶劑的老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制效果的影響。

1.2.2 提取條件單因素實驗 提取溶劑為80%乙醇溶液,超聲功率210 W,超聲時間120 min,料液比1∶15 (g/mL)。按以上超聲波提取條件,考察超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃條件下老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果的影響。

提取溶劑為80%乙醇溶液,超聲功率210 W,超聲溫度50 ℃,料液比1∶15 (g/mL)。按以上超聲波提取條件,考察超聲時間為60、90、120、150、180 min條件下老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果的影響。

提取溶劑為80%乙醇溶液,超聲功率210 W,超聲溫度50 ℃,超聲時間120 min。按以上超聲波提取條件,考察料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)條件下老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果的影響。

1.2.3 提取條件響應面優化試驗 根據單因素試驗結果,選出酶抑制效果適宜的因素和水平,根據Box-Behnken試驗設計[20-21],對超聲溫度,超聲時間和料液比進行3因素3水平的響應面試驗,優化超聲波輔助提取條件[22-23]。試驗因子和水平如表1所示。

表1 試驗因子和水平表Table 1 Factors and levels in the experimental design

當油箱沿縱向向外增加0.1m時，油箱的總體積增加100L(圖7)。油箱體積的增加使油液與油箱的散熱接觸表面積變大，同時也增加了油箱中油液的體積，降低了液壓系統的溫度。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[(A1-A0)/A2]×100

1.2.5α-淀粉酶抑制率的測定 96孔板加入0.5 U/mL的α-淀粉酶液50 μL,0.5 mg/mL老山芹提取液100 μL,混合均勻,于37 ℃孵育10 min后,加入0.2%淀粉溶液50 μL,于37 ℃水浴10 min后,加入顯色劑(5 mmol/L I2和5 mmol/L KI溶于1 mol/L HCl)100 μL終止反應,高速振蕩混合均勻后,在酶標儀上于620 nm處測定吸光度A1,另取100 μL pH6.8磷酸鹽緩沖液代替老山芹提取液,測定吸光度A0,再測定只有老山芹提取液反應體系的吸光度A2。利用經過響應面優化后的提取條件得到提取液,將2 mg/mL的原液分別稀釋1、3、5、7、9、11、13倍后測定α-淀粉酶活性被抑制50%時的抑制劑濃度[28],即IC50。每組試驗3次平行,公式如下。

α-淀粉酶抑制率(%)=[(A1-A0)/A2]×100

1.3 數據處理

采用Miscresoft office Excel 2013、Origin 8.5、Design-Expert 8.0.5、SPSS 20.0進行數據處理、圖表制作及數據分析。結果表示為平均值±標準差的形式。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇結果

不同提取溶劑提取出的降血糖功能成分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果如圖1所示。

圖1 溶劑種類對酶抑制率的影響Fig.1 Effect of solvent types on enzyme inhibition rate

由圖1可見,使用80%乙醇溶液作提取溶劑對于α-葡萄糖苷酶的抑制效果高于其他溶劑(p<0.05),抑制率為63.62%。其他提取溶劑的抑制效果依次為無水乙醇>甲醇>乙酸乙酯>60%乙醇溶液>40%乙醇溶液>20%乙醇溶液。而對于α-淀粉酶抑制率,使用無水乙醇作為提取溶劑效果最高為41.79%,其他提取溶劑的抑制效果依次為甲醇>80%乙醇溶液>乙酸乙酯>60%乙醇溶液>40%乙醇溶液>20%乙醇溶液。由于乙醇的溶解性能較好,對植物細胞的穿透能力較強,親水性的成分除蛋白質、粘液質、果膠、淀粉和部分多糖外,大都能在乙醇中溶解,且乙醇毒性小,價格便宜,來源方便,有一定設備即可回收反復使用,而且乙醇的提取液不易發霉變質。甲醇性質與乙醇相似,沸點較低,但有毒性。綜合以上分析,80%乙醇和無水乙醇為適宜提取溶劑,從經濟效益方面考慮,選擇80%乙醇溶液作為后續研究提取溶劑。

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲溫度對老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果的影響 不同超聲溫度提取出的降血糖功能成分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果如圖2所示。

圖2 超聲溫度對酶抑制率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on enzyme inhibition rate

由圖2可見,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均在40～50 ℃呈上升趨勢,在50 ℃時酶抑制率達到最高,此時,α-葡萄糖苷酶抑制率為68.25%,α-淀粉酶抑制率為58.13%。此后,隨著溫度不斷上升,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均處于不斷降低的狀態。原因可能是一定范圍內溫度的升高使得分子運動速度加快,溶質的傳質系數與擴散速度均有所升高,從而有助于降血糖活性物質的溶出;然而，溫度超出一定范圍,會使部分活性成分分解，致使酶抑制率降低。綜合以上數據分析,α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率均在50 ℃時效果最佳。因此,可以確定老山芹提取物對酶抑制率效果最佳超聲溫度為50 ℃,以下實驗將在50 ℃下進行提取。

圖3 超聲時間對酶抑制率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on enzyme inhibition rate

由圖3可見,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均在60～120 min之間呈上升趨勢,并且在120 min時酶抑制率達到最高,此時,α-葡萄糖苷酶抑制率為67.60%,α-淀粉酶抑制率為55.53%。此后,隨著時間增大,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均處于不斷降低的狀態。原因可能是飽和溶液中,超聲時間過長可能會引起部分活性物質的分解。故綜合以上數據分析,α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率均在120 min時效果最佳。因此,可以確定老山芹提取物對酶抑制率效果最佳超聲時間為120 min,以下實驗將在120 min下進行提取。

2.2.3 料液比對老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果的影響 不同料液比提取出的降血糖功能成分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果如圖4所示。

圖4 料液比對酶抑制率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on enzyme inhibition rate

由圖4可見,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均在料液比1∶15 g/mL時酶抑制率效果最好,分別為68.97%和51.53%。當料液比為1∶20、1∶25和1∶30(g/mL)時,α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率逐漸下降。隨著提取溶劑的增加,有效成分擴散達到平衡時的濃度減小,殘留在植物組織中的有效成分的量就越小,且在料液比為1∶15 (g/mL)左右取得最大值;隨著提取溶劑的進一步增加,可能導致其他成分的溶出而影響有效成分的提取。綜合以上數據分析,α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率均在料液比1∶15 (g/mL)時最佳。因此,可以確定老山芹提取物對酶抑制率效果最佳料液比為1∶15 (g/mL),以下實驗將在1∶15 (g/mL)下進行提取。

2.3 響應面優化提取工藝

2.3.1 響應面試驗結果 對提取老山芹中抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶成分方法的響應面優化試驗結果如表2所示。

表2 響應面優化試驗結果Table 2 Results of response surface optimization

2.3.2 方差分析結果α-葡萄糖苷酶抑制率的方差分析結果如表3所示。

表3 方差分析表(α-葡萄糖苷酶抑制率)Table 3 Variance analysis Table (the inhibitory rate of alpha glucosidase)

由表3可知,模型的F值為12.27,p值<0.05,說明此模型達到顯著水平,而失擬項的p值>0.05,說明回歸方程對于實際情況來說較吻合,試驗誤差比較小,故可用回歸方程對試驗結果進行分析和預測。B>A>C,說明3個因子對于老山芹提取物對酶抑制率效果的影響順序為:超聲時間>超聲溫度>料液比。由p值可知,A、C因素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用不顯著,B因素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著(p<0.05),而三個因素彼此的交互作用AB、AC、BC對α-葡萄糖苷酶的抑制作用均不顯著。

三個因子經過擬合得到的回歸方程為:Y1=-95.43050+2.37538A+1.55070B+2.46685C-4.57500×10-3AB-2.90000×10-3AC+5.25000×10-3BC-0.018355A2-6.23000×10-3B2-0.099220C2。

α-淀粉酶抑制率方差分析結果如表4所示。

表4 方差分析表(α-淀粉酶抑制率)Table 4 Variance analysis Table(the inhibition rate of alpha amylase)

由表4可知,模型的F值為561.88,p值<0.001,說明此模型達到顯著水平,而失擬項的p值>0.05,說明回歸方程對于實際情況來說較吻合,試驗誤差比較小,故可用回歸方程對試驗結果進行分析和預測。B>C>A,說明3個因子對于老山芹提取物對酶抑制率效果的影響順序為:超聲時間>料液比>超聲溫度。由p值可知,A、B、C三因素以及三個因素彼此的交互作用AB、AC、BC均可極顯著影響α-淀粉酶的抑制率(p<0.01)。

三個因子經過擬合得到的回歸方程為:Y2=-738.14850+6.58600A+8.27590B+19.47970C-0.012850AB-0.043000AC-0.052700BC-0.044935A2-0.029535B2-0.35814C2。

2.3.3 響應面圖和等高線圖分析α-葡萄糖苷酶抑制率響應面圖和等高線圖如圖5～圖7所示。

圖5 Y1=f(A,B)的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour drawing on Y1=f(A,B)

圖6 Y1=f(A,C)的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour drawing on Y1=f(A,C)

圖7 Y1=f(B,C)的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour drawing on Y1=f(B,C)

各因素交互作用對α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應曲面以及等高線如圖5、圖6和圖7所示。在單因素實驗后所選擇的范圍內存在極值,是響應面的最高點。響應面圖坡度的陡峭程度直觀反應了各因素對響應值的影響,兩兩因素間均有交互作用,交互效應的強弱由等高線的形狀反映,橢圓形表示兩因素之間的交互作用顯著,圓形則正好相反。其中,超聲溫度和超聲時間的交互作用最強,表現為所對應的等高線偏橢圓;提取溫度和料液比的交互作用最弱,表現為等高線偏圓。

α-淀粉酶抑制率的響應面圖和等高線圖分析如圖8～圖10所示。

圖8 Y2=f(A,B)的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour drawing on Y2=f(A,B)

圖9 Y2=f(A,C)的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour drawing on Y2=f(A,C)

圖10 Y2=f(B,C)的響應面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour drawing on Y2=f(B,C)

各因素交互作用對α-淀粉酶抑制率影響的響應曲面以及等高線如圖8、圖9和圖10所示。在單因素實驗后所選擇的范圍內存在極值,是響應面的最高點。響應面圖坡度的陡峭程度直觀反應了各因素對響應值的影響,兩兩因素間均有交互作用,交互效應的強弱由等高線的形狀反映,橢圓形表示兩因素之間的交互作用顯著,圓形則正好相反。其中,超聲時間與溫度、液料比與超聲溫度、超聲時間與液料比三者的交互作用對α-淀粉酶抑制率影響較強,表現為所對應的等高線呈橢圓。

2.3.4 最佳提取工藝條件的確定及驗證 利用Design-Expert中的Box-Behnken模型,在回歸方程基礎上計算得出理論上最佳提取工藝條件為:超聲溫度49.37 ℃,超聲時間114.54 min,料液比1∶15.31 g/mL。在此條件下,α-葡萄糖苷酶抑制率理論上為70.6405%,α-淀粉酶抑制率為56.6247%。

為了檢驗試驗結果與理論情況是否一致,在80%乙醇溶液、超聲溫度49 ℃、超聲時間114.5 min、料液比1∶15.3 g/mL的試驗條件下重復3次試驗,α-葡萄糖苷酶抑制率平均為69.52%±1.13%,α-淀粉酶抑制率平均為56.38%±0.96%,與理論值均較為接近,故說明回歸模型得出的經過優化后的提取條件是正確可行的。經過IBM SPSS Statistics回歸分析,老山芹提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的IC50為0.169 mg/mL,對α-淀粉酶的抑制作用的IC50為0.339 mg/mL。

3 結論

通過單因素和響應面優化試驗,綜合回歸模型分析和驗證試驗,從老山芹中提取對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有抑制作用的物質的最佳條件為:80%乙醇溶液、超聲溫度49 ℃、超聲時間114.5 min、料液比1∶15.3 g/mL。在此條件下,α-葡萄糖苷酶抑制率為69.52%±1.13%,α-淀粉酶抑制率為56.38%±0.96%,半數抑制濃度(IC50)分別為0.169和0.339 mg/mL。說明老山芹提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的物質。