紫果西番蓮果皮中 多酚提取工藝的比較及優化

張 玲,馬于然,李春海,*

(1.廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心,廣東普通高校食品科學創新團隊, 廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心,廣東茂名 525000; 2.廣東石油化工學院環境與生物工程學院,廣東茂名 525000)

近年來人們對多酚的研究越來越深入,現代醫學研究表明[1-3],多酚具有較強的抗氧化、抗老化、降血壓、降低膽固醇、抗癌、抗骨質疏松等功效,能夠有效預防和抑制某些疾病[4-6]。

西番蓮(Passifloraedulis)俗稱百香果、雞蛋果,屬西番蓮科,原產于澳大利亞和巴西,現在廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區,我國廣東、海南、福建、臺灣等地區種植西番蓮已有很長的歷史了[7]。目前對于西番蓮的使用主要是用于生產果汁,而果皮的利用比較少,這樣既浪費資源也污染環境[8]。許多研究表明,西番蓮果皮中的黃酮、多酚等物質具有抗氧化作用,可以起到抑制衰老、細胞退化的作用,具有防癌、抗菌消炎、改善血液循環、降低膽固醇等多種對人體有利的功效[9]。

趙玉紅等[10]采用有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法和超聲波-復合酶法對樟子松樹皮中的松多酚進行提取,多酚得率分別為12.56、23.01、30.12 mg/g。王華斌等[11]采用酶法對石榴皮中的多酚進行提取,結果表明,酶法提取石榴皮中多酚的提取率比溶劑浸提法高出16.84%。段宙位等[12]采用酶輔助有機溶劑浸提法提取沉香葉多酚,探討了酶種類對多酚得率的影響,結果表明,纖維素酶輔助乙醇法提取沉香葉多酚的效果最好。但目前關于利用西番蓮果皮提取多酚相關研究報道較少。

本試驗主要研究紫果西番蓮果皮中多酚的提取方法,優化并比較了有機溶劑提取法和纖維素酶輔助提取法兩種方法的最優工藝條件和提取效果,尋求一種更加合理、高效、經濟的提取方法和提取工藝條件,為西番蓮果皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫果西番蓮 產自廣東茂名;無水乙醇 分析純,天津市大茂化學試劑廠;沒食子酸 分析純,天津市大茂化學試劑廠;纖維素酶(酶活力785 U/mg) 江蘇銳陽生物科技有限公司;福林酚 分析純,上海展云化工有限公司。

722G型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;LFP-800A型高速多功能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;DZF-6090型立式真空干燥箱 上海東麓儀器設備有限公司;JA3003型電子天平 上海宇恒平科學儀器有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州博遠試驗分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 西番蓮果皮粉的制備 挑選新鮮無霉變無腐爛的紫果西番蓮,取果皮,清洗后切成細條,于40 ℃下真空干燥后,用粉碎機將果皮粉碎,過60目篩,得果皮粉,備用。

1.2.2 沒食子酸最大吸收波長的確定 吸取3 mL濃度為0.020 mg/mL的沒食子酸標準溶液于10 mL顯色管中,加入1 mL的福林酚試劑,混合,搖勻,1 min內加入3 mL 10%的碳酸鈉溶液,加蒸餾水定容至10 mL,于暗處反應1 h,以1 mL蒸餾水相同條件處理,以此為參比。用可見分光光度計在700～900 nm波長內掃描測定最大吸收波長。

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1.2.3 沒食子酸標準曲線的繪制 分別配制沒食子酸標準溶液0、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL,按1.2.2中確定的最大吸收波長處測其吸光度。以沒食子酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標,以其吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 多酚的乙醇提取工藝研究 稱取西番蓮果皮粉1 g于250 mL三角瓶中,加入一定體積濃度的乙醇水溶液,在一定溫度的恒溫水浴鍋中浸提一段時間后,抽濾,吸取1 mL濾液定容于10 mL的容量瓶中,采用福林酚法測定多酚并計算其多酚得率。

1.2.5 多酚得率的測定 多酚的測定采用福林酚法,參考田樹革等[13]的研究,計算多酚得率(X,mg/g),公式如下。

式中:C為校準曲線總多酚濃度,mg/mL;V1為稀釋倍數;V2為提取液體積,mL;M為果皮質量,g。

1.2.6 正交優化試驗 在單因素預實驗基礎上,確定正交試驗的因素和水平,采用L9(34)正交優化試驗,研究乙醇體積分數、料液比、提取時間和浸提溫度4個因素對多酚得率的影響,篩選出最優的提取工藝條件。

1.2.7 多酚的纖維素酶輔助提取工藝研究 稱取西番蓮果皮粉1 g于250 mL三角瓶中,加入一定量的磷酸鹽緩沖溶液和纖維素酶粉,在一定pH、一定溫度下水浴浸提一段時間,抽濾得濾液,測其多酚;將濾渣加入60%乙醇,在40 ℃水浴中浸提150 min,結束后抽濾,測定濾液多酚。將兩次測定的多酚合并,計算酶法輔助提取多酚的得率。

1.2.8 單因素實驗 分別考察纖維素酶量(0、10、15、20、25、30 mg/g),液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL/g),pH(3、4、5、6、7),酶解時間(20、40、60、80、100、120 min),酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)5個單因素對多酚得率的影響。得到濾渣后,將濾渣按照乙醇提取法正交優化條件進行提取。測定兩次提取的多酚含量,合并計算多酚得率。研究某一單因素影響時,其他條件取固定值,分別為纖維素酶用量取20 mg/g,酶解溫度40 ℃,pH5,提取時間60 min,液料比30 mL/g。

1.2.9 正交優化試驗 由單因素試驗結果顯示,酶解pH的影響相對于其它幾個因素的影響是最小的,因此在正交試驗階段剔除對酶解pH這個因素的優化。因此,選取纖維素酶的量、液料比、酶解溫度、酶解時間4個對多酚得率影響比較大的單因素進行L9(34)正交優化試驗,研究各個因素對多酚得率的影響,篩選出最優的提取工藝條件。正交優化試驗因素水平如表1所示。

表1 乙醇提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of ethanol extraction orthogonal test

表2 纖維素酶輔助提取法正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal extraction of cellulase

1.3 數據處理

以上實驗每組均平行進行三次,取均值;采用SPSS Statistics V 19.0軟件對正交實驗結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸最大吸收波長的確定

圖1 沒食子酸溶液吸光值波段掃描Fig.1 Spectral scanning of absorbance value of gallic acid solution

2.2 沒食子酸標準曲線的制作

以沒食子酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標,以其吸光值(A)為縱坐標繪制標準曲線,如圖2所示,擬合回歸方程為:y=12.457x+0.0086,R2=0.9981,說明吸光值與濃度線性關系良好。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

2.3 乙醇提取工藝

在單因素實試驗的基礎上,以多酚得率為指標,采用L9(34)進行正交試驗,結果如表3所示。

表3 正交試驗結果與極差分析Table 3 Orthogonal test results and range analysis of ethanol extraction

結合表3和表4,4個單因素對西番蓮果皮中多酚得率的影響的主次順序為B>A>D>C,即液料比>乙醇體積分數>浸提溫度>提取時間,最優組合為A3B2C3D1。因為最優組合在上述9組試驗中沒有出現,需要進行驗證試驗。在乙醇體積分數為60%,液料比為30∶1 mL/g,提取時間為150 min,浸提溫度為40 ℃的條件下提取西番蓮果皮中的多酚,平行實驗3次,結果多酚的得率為(11.648±0.118) mg/g。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 纖維素酶輔助提取工藝條件研究

2.4.1 單因素分析

2.4.1.1 纖維素酶的用量對多酚得率的影響 纖維素酶的用量對多酚得率的影響如圖3所示。

圖3 纖維素酶的量對多酚得率影響Fig.3 Effect of cellulase amount on polyphenol yield

由圖3可知,兩個提取階段柱形圖顯示多酚的溶出主要在酶解階段,乙醇浸提階段的多酚得率相對較少,這是因為在前部分的浸提時間中西番蓮果皮中的多酚大部分被浸出,還有小部分多酚沒有完全浸提,在乙醇提取階段被浸提出來。但從總體上看兩個階段的多酚得率趨勢與總的趨勢相一致,都是隨著纖維素酶用量的增加,多酚得率呈先增大后減小最終趨于平穩的趨勢。這是因為第1階段纖維素酶的破壁效果和膜的滲透性隨著酶用量的上升而上升,當酶的量達到飽和時,酶解反應比較完全,如果繼續增加酶的量只會降低酶與底物的接觸面積,酶解的作用反而被抑制[17]。第1階段纖維素酶的破壁效果越充分對于第2階段乙醇浸提也有一定促進作用。因此選擇纖維素酶用量為20 mg/g比較適合。

2.4.1.2 液料比對多酚得率的影響 液料比對多酚得率的影響見圖4。

圖4 液料比對多酚得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on polyphenol yield

由圖4可知,酶解階段的多酚得率與總多酚得率趨勢相一致,呈先上升后緩慢下降的趨勢,這是因為隨著液料比的增加,底物與酶、底物與溶劑接觸完全,多酚得率就呈上升的趨勢,但當液料比大于35∶1 mL/g以后,繼續增加液料比,纖維素酶的有效作用濃度被稀釋,酶與底物的有效接觸面積變小,酶解不充分,最終多酚得率下降。第2階段即乙醇浸提階段呈下降趨勢是因為在第1階段過低的液料比使得西番蓮果皮粉與溶劑接觸不完全[18],多酚不能很好地溶出,在第2階段乙醇浸提的體積相同的條件下,第1階段有較多的多酚沒有被充分溶出在第2階段就能比較完全地溶出。從總體上分析可知,選擇酶解的液料比為35∶1 mL/g比較合適。

2.4.1.3 pH對多酚得率的影響 由圖5可知pH對多酚得率的影響。

圖5 pH對多酚得率的影響Fig.5 Effect of pH on polyphenol yield

由圖5可知,在酶解階段、乙醇提取階段多酚得率與總多酚得率變化趨勢比較一致,均先上升后下降,這說明纖維素酶在pH5左右的酶解條件下,酶的活性比較大,在此范圍內能夠發揮最大活力,破壁效果比較好,加快分解西番蓮果皮中纖維素成分,從而加快了果皮細胞中多酚的溶出。當酶解pH過高或過低都會影響到纖維素酶的活性,使得在酶解階段和乙醇浸提階段的多酚得率都會受到影響,最終使得多酚得率減小[18]。因此選擇酶解pH5的酶解條件比較合適。

2.4.1.4 酶解時間對多酚得率的影響 圖6顯示的是酶解時間對多酚得率的影響。

圖6 酶解時間對多酚得率的影響Fig.6 Effect of time on polyphenol yield

由圖6可知,酶解時間在60 min內多酚得率變化比較明顯,呈明顯上升趨勢。當時間超過60 min后多酚得率比較穩定,有較小幅度的下降趨勢。這是因為隨著時間的延長,纖維素酶發揮作用比較充分,西番蓮果皮中的纖維素類物質被分解,從而使更多的多酚類物質被溶出;當時間過短酶解不充分,多酚溶出較低;時間過長有少量的多酚容易被氧化而轉化為其他物質,導致多酚含量有下降趨勢[19]。因此選擇酶解時間為60 min效果比較好。

2.4.1.5 酶解溫度對多酚得率的影響 酶解溫度對多酚得率的影響如圖7所示。

圖7 酶解溫度對多酚得率的影響Fig.7 Effect of temperature on polyphenol yield

由圖7可以看出,隨著溫度的升高,酶解階段、乙醇浸提階段多酚得率和總多酚得率都呈先增加后下降的趨勢。酶解溫度在40～60 ℃時多酚得率都比較高,可見纖維素酶在40～60 ℃時酶活性比較高,纖維素酶解充分,細胞破碎比較完全,多酚溶出完全。溫度過高或過低,纖維素酶都會受到抑制[19]。同時,多酚是一種熱敏感性物質,溫度過高會導致多酚損失,因此,在酶解階段60 ℃以上的條件下多酚得率有所下降[20]。從總多酚得率來看,選擇50 ℃的酶解溫度比較合適。

2.4.2 纖維素酶輔助提取法正交優化 以多酚得率為指標,采用L9(34)進行正交試驗,結果如表5所示。

表5 正交試驗結果與極差分析Table 5 Orthogonal test results and range analysis of ethanol extraction

結合表5和表6,4個單因素對西番蓮果皮中多酚得率的影響的主次順序為B>A>D>C,即液料比>纖維素酶的量>酶解時間>提取溫度,最優組合為A3B2C1D2。因為最優組合在上述9組試驗中沒有出現,需要進行驗證試驗。在酶解階段提取工藝條件為:纖維素酶用量為25 mg/g,液料比為35 mL/g,酶解溫度40 ℃,酶解時間為60 min,乙醇提取階段:乙醇體積分數60%、液料比30 mL/g、時間150 min、溫度40 ℃條件下提取西番蓮果皮中的多酚,平行實驗3次,結果多酚的得率為(15.096±0.0948) mg/g。

表6 正交試驗方差分析表Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結論

在乙醇體積分數為60%,液料比為30∶1 mL/g,提取時間為150 min,浸提溫度為40 ℃的條件下提取西番蓮果皮中的多酚,在此條件下,結果多酚的得率為(11.648±0.118) mg/g。纖維素酶輔助提取的最佳條件為纖維素酶用量為25 mg/g,液料比為35∶1 mL/g,酶解溫度40 ℃,酶解時間為60 min,結果多酚的得率為(15.096±0.0948) mg/g。由乙醇提取法和纖維素酶輔助提取法的正交試驗分析得出的最優提取條件,并通過驗證實驗,最優條件下酶解提取,再按照單獨乙醇提取法的最優條件2次提取,多酚得率比單純乙醇提取法的多酚得率約高了29.6%。實驗證明,采用纖維素酶輔助提取能夠有效提高多酚得率,這是由于纖維素酶能夠分解植物細胞壁,而且西番蓮果皮中還有較多的粗纖維,起到除雜的作用,使細胞內物質能夠更好地被提取出來。