葛根素純化工藝及其解酒效應

鄭 強,李 超,王 平,韓 琴,劉 新

(成都醫學院公共衛生學院,四川成都 610500)

葛根始載于《神農本草經》,為豆科植物野葛 Pueraria lobata(Willd)Ohwi的干燥根,具有解肌退熱、解酒護肝等功效,臨床上主要用于外感發熱頭痛、高血壓、頸項強痛、口渴等癥[1-4]。葛根素(Puerarin)是從野葛的干燥根中提取出的主要成分,其化學結構為 4,7-二羥基-8-B-D 葡萄糖異黃酮。研究發現其具有抗炎、抗氧化、降糖、抗癌、解酒護肝等多種功能活性[2]。葛根素作為天然植物成分具有毒性低、功效明顯等特點,越來越受到研究者關注。目前從葛根中分離純化葛根素的方法主要是大孔樹脂吸附法、聚酰胺柱層析吸附法、鹽析法、酸水減法、絡合萃取技術、紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳等[5-7],目前吸附法中以大孔樹脂作為吸附劑在黃酮類化合物的純化工藝中應用較多[8],然而大孔樹脂材料中含有苯類化合物,故在食品等領域使用受限。葡萄糖凝膠具有化學性質穩定,吸附作用大,無毒無害和可重復利用等特點。本文采用響應曲面法優化純化過程中的洗脫次數、液料比以及乙醇濃度,獲得葡萄糖凝膠柱純化葛根素的最佳工藝,并將樣品試用于小鼠模型,利用氣象色譜法對所獲得的樣品進行了解酒功效評價,確保了樣品的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 月齡2～3月,雄性30 g左右30只,合格證號SCXK(川)2015-030,四川達碩動物中心;葛根和葛根素標準品 (批號:PRF7090641,純度99.2%)由成都普瑞法科技有限公司提供;葡聚糖凝膠G-10 上海一基實業有限公司;甲醇 色譜純,成都市科龍化工試劑廠;醫用生理鹽水、無水乙醇 分析純,成都市科龍化工試劑廠;52度瀘州老窖 2013年生產,瀘州老窖股份有限公司。

WAYEE3000型高效液相色譜儀 安徽晥儀科技股份有限公司;UV5000型紫外/可見分光光度計 安徽晥儀科技股份有限公司;LCS3000Q型工作站、GC7000型氣相色譜儀 天美科學儀器有限公司;冷凍離心機 Thermo公司;THZ-82型恒溫振蕩器 國華企業;ISO-9001型電子天平、FY135型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根粗提物的制備 參考課題組前期操作曹雄等[9]的實驗方法稱取1.000 g干燥的葛根粉末,在乙醇體積分數50%、提取時間70 min、提取溫度60 ℃條件下恒溫振蕩得葛根粗提物。

1.2.2 單因素實驗 稱取葡聚糖凝膠2 g置于錐形瓶中,加蒸餾水至30 mL,97 ℃水浴3 h,冷至室溫后裝柱備用。

探究實驗中各因素對葛根素純化率的影響,選取乙醇體積分數、液料比、洗脫次數3個因素,每次取1 mL樣品,固定其中一個因素條件,其他兩個條件按設定的梯度進行單因素操作,洗脫劑為不同濃度的乙醇,分別考察洗脫液體積分數(60%、65%、75%、85%、90%,固定液料比4∶2，洗脫次數為6),液料比(即洗脫劑與凝膠的體積比)(3∶2、4∶2、5∶2、6∶2、7∶2，固定乙醇體積分數為65%，洗脫次數為6),洗脫次數(1、2、3、4、5、6、7、8次，固定乙醇體積分數65%，液料比4∶2)每組實驗重復3 次,計算每組實驗葛根的純化率。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗結果,選取洗脫液濃度、料液比和洗脫次數3個因素,以葛根素純化率為響應值,根據Box-Behnken試驗設計原理,設計3因素3水平響應面試驗,見表1。利用Design-Exper 8.0軟件對響應面結果數據進行分析處理,進行二次型變異分析。

表1 響應面因素水平設計和編碼表Table 1 Response surface factors and coded levels

1.2.4 純化率的測定 將0.1 mg/mL的葛根素標準液,按梯度準確吸取不同體積的標準液置于10 mL容量瓶中,分別配制5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 μg/mL的標準溶液。分光光度計于波長250 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,并求得回歸方程。得到葛根素標準曲線:y=0.17563x+0.02071(R2=0.99901),在250 nm[10]下用分光光度計分別測純化所得樣品吸光度值,根據標準曲線計算每個樣品中葛根素含量,并和葛根素粗提物含量進行比較得到葛根素的純化率。

1.2.5 純化物的HPLC檢測 采用高效液相色譜法分析樣品中的葛根素,檢測參數為:Allsphere ODS色譜柱(4.6×250 mm,25 μm);流動相為甲醇∶36%乙酸∶蒸餾水=25∶3∶72;柱溫30 ℃;流速0.8 mL/min;檢測波長250 nm。樣品稀釋80倍后經0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣,葛根素標準品按照300[11]。

1.2.6 小鼠急性酒精中毒模型的制備及分組 將小鼠隨機分為4組,每組10只,包括葛根素標準品組(PE)、葛根素純化液組(PP)和酒精模型組(AM)、空白對照組(Con)。PE組腹腔注射劑量為250 μg/(kg·d)的葛根素標準品注射液,PP組腹腔注射劑量為260 μg/(kg·d)的葛根素純化液,AM組對照組腹腔注射250 μg/(kg·d)的生理鹽水注射液,3組腹腔注射30 min后都以16 mL/kg劑量用52度的白酒灌胃[12],Con組每天以16 mL/kg注射生理鹽水,按此法操作重復至第4 d。灌胃第2 d進行翻正反射消失試驗:灌酒后開始計時,記錄各組小鼠翻正反射消失(即醉酒)時間和翻正反射恢復(即醒酒)時間。

1.2.7 葛根素純化物解酒效果評價 灌胃第4 d,灌胃給予白酒30 min后,各組斷頸取血,分別加入40 μL肝素鈉,3500 r/min,4 ℃離心5 min,取上清液過0.45 μm微孔濾膜備用,氣相色譜檢測,參數為:氣流壓力0.4 MPa;進樣口溫度200 ℃;FID檢測器溫度220 ℃;柱溫70 ℃[13]。對血液樣品中乙醇含量進行定量檢測,并繪制乙醇標準曲線:取8.008 g無水乙醇加蒸餾水定容至100 mL,獲得濃度為80 mg/mL的乙醇標準儲備液[14]。取1 mL儲備液,用蒸餾水梯度稀釋出濃度分別為10、5、2.5、1.25和0.625 mg/mL的標準乙醇溶液。分別進樣檢測,以乙醇標準溶液的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,并求得回歸方程,記錄各組樣品的含量,每組重復進樣3次。

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數對葛根素純化率的影響 根據250 nm處吸光度計算出各實驗中獲得樣品的葛根素含量。隨著乙醇溶液體積分數的增加,葛根素純化率也隨之增加，到達65%達到最高，體積分數大于65%后葛根素的純化率呈下降趨勢,其原因可能是由于隨著醇濃度的增大,溶劑極性減小,非極性物質溶出增多導致葛根素的提取率降低[5],故乙醇體積分數宜控制在65%具有最佳效果。

圖1 乙醇體積分數對純化率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on purificationrateon rate

2.1.2 料液比對葛根素純化率的影響 料液比對葛根素純化率的影響是隨著提取液體積的增加,葛根素純化率是先降低后增大,即液料比在4∶2時具有最大純化率,在液料比為5∶2時純化率最低,而當液料比為6∶2時,葛根素的純化率有所增加,但仍低于4∶2時的純化率。究其原因可能和吸附劑葡萄糖凝膠的吸附性與葛根素的含量相關[5]。

圖2 液料比對純化率的影響Fig.2 Effect of liquid ratio on purification rate

2.1.3 洗脫次數對葛根素純化率的影響 結果顯示洗脫次數的增加,葛根素純化率先趨于穩定狀態,到第四次洗脫后純化率明顯增大,到第6次洗脫后再次降低。洗脫次數少不能使葛根素完全從凝膠中分離出來,如果過多的洗脫,反而會增大乙醇體積分數從而降低葛根素含量,故6次洗脫具有最佳純化效果。

圖3 洗脫次數對純化率的影響Fig.3 Effect of wshingn time on purification rate

2.2 響應面試驗設計與結果

基于單因素試驗結果確定的最佳條件,以乙醇體積分數、液料比、洗脫次數,這3個因素為自變量(以ABC表示),以葛根素純化率為響應值設計3因素共17個試驗點的 三元二次回歸正交組合實驗[15],實驗結果見表4。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

方差分析結果見表5,對響應值和各因素進行回歸擬合,得到葛根素純化率對應的二次多項回歸方程Y=50.59+2.86A+7.07B-15.59C-0.44AB-11.42AC+6.09BC-21.15A2+4.98B2-3.54C2,對二次方程進行方差分析,模型p<0.0001,此時回歸方差模型極顯著,該實驗方法可靠,方程失擬項為0.1939(p>0.05),即失擬項不顯著,說明回歸方程能較好的和測定值擬合?；貧w系數R2=0.9808,表明該擬合方程相關度較好,方法可靠?；貧w方程的方差分析表明:A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2均達到顯著水平(p<0.05),根據F值的大小,選定的因素對葛根素純化率的影響大小依次為乙醇體積分數、液料比和洗脫次數。響應面Y對于因素A、B、C值構成三維平面和由它構成的二維空間等高圖可直面、客觀的反映影響葛根素純化率各因素之間的相互作用關系,見圖4～圖6。

圖4 洗脫次數和液料比數對純化率的影響Fig.4 Effect of elution times and t liquid ratio on purification rate

圖5 洗脫次數和乙醇體積分數對純化率的影響Fig.5 Effect of elution times and the volume fraction of ethanol on purification rate

圖6 液料比和乙醇體積分數對純化率的影響Fig.6 Effect of liquid ratio and the volume fraction of ethanol on purification rate

根據響應面法的模型,如果一個響應曲面坡度相對平緩,表示其對響應值影響不大,相反,如果一個響應曲面坡度比較陡峭,表示其對響應值影響較大[7],預測最優純化工藝為:洗脫次數6、液料比為4∶2、乙醇體積分數為65.39%,該條件下葛根素的純化率為69.88%。根據實際操作情況,將純化工藝參數設定為洗脫次數6、液料比為4∶2、乙醇體積分數為65%,為了驗證所得實驗結果是否與響應面模型是否相符,在此條件下進行3組平行實驗,得到葛根素純化率為70.56%±0.85%,顯示該回歸模型預測性較好。

2.3 高效液相色譜檢測

HPLC檢測結果如圖7所示,根據峰高和峰面積,可明顯看出純化前后提取液中葛根素含量有所增加,并且純化后所含成分種類有所減少。說明經過葡萄糖凝膠純化后能降低提取物中雜質含量,提高葛根素的含量,根據液相色譜峰高計算得到葛根素濃度含量為26.22 μg/mL。

圖7 不同樣品的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC detection results of different samples注:a:葛根素標準溶液(1.5 μg/mL); b:葛根純化前的樣品;c:葛根純化后的樣品。

2.4 葛根素純化物解酒效果評價

由表4可知,葛根對照品和葛根素純化物能顯著延長急性酒精中毒小鼠的醉酒潛伏期,縮短醒酒時間,與模型組比較,差異具有顯著性意義(p<0.05)。此結果說明葛根素純化物對醉酒具有良好的預防效果,功效與葛根素標準品相近[16]。

表4 葛根素的抗醉酒實驗結果Table 4 The anti drunk experimental results of puerarin

根據乙醇標準曲線y=320659.579x+63560(r=0.99859),計算出各組小鼠血液中乙醇含量(表5)。正常對照組小鼠血液未檢出有酒精。葛根素純化物能夠降低小鼠體內的乙醇濃度,與模型組比較差異具有顯著性意義(p<0.05),其功效和葛根素標準品相一致。

3 結論

本研究確定了葡萄糖凝膠純化葛根素的最佳工藝條件為:洗脫液為65%乙醇,洗脫次數為6次,液料比4∶2,得到葛根素純化率為70.56%±0.85%。所獲得樣品經HPLC檢測為與葛根素標準品一致,測定其濃度為26.22 μg/mL。解酒實驗研究證實純化后葛根素含量較高,雜質較少,生物活性與標準品接近,利用葡萄糖凝膠柱進行吸附純化具有安全、操作簡便等特點,為后續葛根素藥用食用價值的研發奠定基礎,故該工藝在葛根素純化方面具有較大優勢。