運用HSCCC法分離純化荷葉中 三種黃酮及抗氧化活性

潘 匯,蔡為榮,謝亮亮,張 杰

(安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

荷葉(Lotus leaf)系睡蓮科屬(Nymphaeaceaegenus)植物,生長在池塘以及湖泊中,中國荷葉資源豐富,在長江、黃河流域均有分布[1-2]。荷葉自古以來都被以藥食兩用的植物在民間應用,據《本草綱目》記載:“荷時服之,令人瘦劣,單服可以消陽水浮之氣”。1991年11月中華人民共和國衛生部的衛監發(1991)第45號文件中,荷葉被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單之中[3]。

現代藥理研究證明荷葉含有多種具有生理活性的物質,其中生物堿、黃酮類是荷葉中的主要活性成分[4]。黃酮類成分主要包括槲皮素、槲皮苷、紫英云苷、金絲桃苷等。研究表明荷葉中的黃酮類物質具有抗氧化、清除自由基[5]、消炎、鎮痛、降血脂[6]、抗癌、抗腫瘤[7]等顯著的生理活性。當前在荷葉黃酮分離純化方面主要的方法有離子沉淀、膜分離、超濾、柱色譜技術、制備型高效液相色譜以及高速逆流色譜技術等[8]。單一的柱色譜分離純化荷葉黃酮很難得到黃酮單體,制備型高效液相色譜制備荷葉黃酮單一處理的荷葉黃酮的量較小,工作較為繁重,很難對其進行大規模的推廣。

高速逆流色譜是一種無固定相支撐的液-液色譜分離技術,它的固定相和流動相都是液體,沒有不可逆吸附,具有樣品無損失、無污染、高效、快速和大制備量分離等優點。盛達成等[9]利用高速逆流色譜技術在荷葉粗黃酮粉末中成功分離出純度超過90%的槲皮素單體。鄧勝國等[10]利用高速逆流色譜從荷葉中分離出三種荷葉黃酮苷。孫清華等[11]利用高速逆流色譜技術在中藥知母中分離得到四種純度超過90%的化合物。本研究以荷葉為原料,在高效液相色譜技術分析荷葉黃酮的基礎上,通過對不同的兩相溶劑系統的優化選擇,建立高速逆流色譜法分離純化荷葉黃酮的技術方法。為進一步開發利用荷葉黃酮類物質資源提供理論與技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉 (選用體格較大的荷葉采摘晾曬)2017年8月采摘于安徽工程大學校內池塘;乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、三氯甲烷、甲酸 分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;甲醇 色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽) 美國sigma公司;蒸餾水 實驗室自制;超純水 上海合泰純水機有限公司;槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、紫英云苷標準品 北京普天同創生物科技有限公司。

TBE-300B型高速逆流色譜儀(HSCCC)、聚四氟乙烯柱(管直徑2.6 mm,柱體積310 mL,轉速0～900 r/min)、TBD-2000 檢測器、恒溫水浴中壓恒流泵 中國上海同田生化技術有限公司;Waters高效液相色譜系統配備waters C18柱(150×4.6 mm)2998二極管陣列檢測器 美國沃特世公司;722型可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;KQ-250E型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷葉黃酮粗品樣品的制備 荷葉經烘箱40 ℃烘至恒重后經粉碎機粉碎后過80目篩子,精密稱取100 g荷葉粉末,加入到2 L已煮沸的蒸餾水中繼續煮沸30 min,抽濾,浸提兩次,合并兩次濾液得到荷葉水提液。對所得的荷葉水提液在40 ℃,壓強為-0.09 MPa條件下進行減壓濃縮至100 mL。用經過預處理后的大孔樹脂AB-8對荷葉水提液進行純化,濃縮液一次上樣50 mL,用蒸餾水以2 BV/h的流速洗去蛋白質、多糖等雜質至無色,用70%乙醇溶液以2 BV/h進行洗脫,收集洗脫液,在40 ℃條件下減壓濃縮后進行冷凍干燥得到初步純化的荷葉黃酮。

1.2.2 HSCCC法分離純化 荷葉黃酮溶劑體系的選擇速逆流色譜分離純化荷葉黃酮溶劑體系的選擇,參照鄧盛國[12],李強[13],劉人民[14]等利用HSCCC對植物黃酮進行分離的溶劑體系結合樣品情況,本研究設計以下兩相溶劑系統:a.氯仿∶甲醇∶水(體積比為4∶3∶2);b.氯仿∶甲醇∶水(體積比為2∶2∶1);c.正丁醇∶甲醇∶水(體積比為5∶1∶4);d.正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為1∶6∶1∶6);e.正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為1∶3∶1∶3)。

1.2.3 HSCCC分離純化 荷葉黃酮組分溶劑體系的制備按照1.2.2的溶劑體系配制兩相溶劑,按照比例量取所需體積的溶劑置于分液漏斗中搖勻兩相溶劑,記錄分層時間,靜置30 min達到平衡。分離出上下相,250 W功率下超聲脫氣20 min。以上相作為固定相,下相作為流動相。

樣品制備:取100 mg經大孔樹脂純化后荷葉黃酮凍干樣用10 mL下相超聲溶解待用。

分離流程:以40 mL/min的流速泵固定相,待出口處有穩定的液體流出停止,啟動高速逆流色譜儀至正轉850 r/min。以2 mL/min泵流動相至出口所接的流出液出現明顯分層,計算固定相保留值。在254 nm的檢測波長下進行譜圖采集,根據譜圖出峰情況收集流出液組分，將收集得到流出液減壓濃縮，冷凍干燥得到目標組分粉末，用分析天平稱量各目標組分質量。

保留值(%)=(V總-V流)/V總×100

式中V總(mL)為柱總體積,V流(mL)為固定相被流動相排出的體積。

1.2.4 分配系數K的測定 分配系數指一定溫度下,處于平衡狀態時,組分在固定相中的濃度和在流動相中的濃度之比,以K表示。使用分液漏斗配制好溶劑系統,充分混勻,靜置平衡,并記錄其分層時間T。取適量荷葉黃酮凍干樣用下相溶解,取下相3 mL加入等體積上相充分混合,分離上下相揮干用于高效液相色譜檢測,分配系數K按照下面的公式計算。

K=A1/A2

A1:荷葉黃酮目標組分在上相中的峰面積;A2:荷葉黃酮目標組分在下相中的峰面積。

1.2.5 HPLC分析鑒定 所分離出的荷葉黃酮組分運用HPLC分別分析檢測經大孔樹脂純化后及HSCCC分離后的荷葉黃酮組分。參考葉曉蘭等[15]測定陳皮黃酮的高效液相色譜條件并結合樣品情況確立液相色譜檢測條件,高效液相色譜條件為:waters C18分析色譜柱(15 cm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進樣體積10 μL,流動相組成為A:甲醇;B:超純水(含0.3%的甲酸)。以40% A相,60% B相進行等度洗脫,檢測波長254 nm,流速0.8 mL/min。用所購得的標準品配置成0.1 mg/mL的溶液,以同樣的色譜條件進行檢測,通過保留時間作為參考來進行對照。

1.2.6 荷葉黃酮組分的抗氧化活性研究 對HSCCC分離所得的荷葉黃酮組分進行抗氧化活性研究。用所得組分進行清除羥基自由基、DPPH、ABTS的能力進行實驗研究。

1.2.6.1 羥基自由基清除率的測定 利用Fenton反應原理產生羥基自由基進行實驗研究。參考顏軍等[16]的方法,在反應體系中加入2 mL 2 mmol/L FeSO4溶液,加入2 mL 6 mmol/L H2O2溶液,加入6 mmol/L的水楊酸6 mL,37 ℃水浴加熱15 min 取出,加入一定濃度的荷葉多酚溶液0.5 mL,37 ℃條件下水浴0.5 h。以蒸餾水為參比液,在 510 nm測定其吸光值,以VC作為陽性對照,計算清除率。

清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

式中:A0位空白對照液吸光值;A1為加入樣品后反應體系吸光值;A2為樣品本底吸光值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測定 參考文獻[17-18]并稍作修改,取DPPH試劑5 mg溶解于100 mL無水乙醇中制得DPPH儲備液,在試管中依次加入2 mL DPPH儲備液和一定濃度的多酚溶液,靜置半小時在519 nm下測試吸光度,以VC作為陽性對照,計算清除率。

清除率(%) =[1-(A1-A2)/A0]×100

其中,A1為實驗組的吸光度;A2為荷葉多酚樣品本身吸光度;A0空白實驗組吸光度。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻[19-20]稍作修改,將ABTS(10 mg)溶解在2.6 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液以制備原液。該混合物在4 ℃條件下避光過夜。將該溶液在甲醇中稀釋至吸光度在734 nm處測量為0.70±0.02。準確吸取0.1 mL不同濃度的荷葉多酚溶液置于試管中,加入3.9 mL的ABTS+工作液,混合搖勻,室溫避光保存1 h,在734 nm條件下測其吸光度A1,采用VC作為陽性對照,對ABTS自由基的清除率按如下公式計算:

清除率(%)=[1-A1/0.070]×100

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 HSCCC分離純化荷葉黃酮條件的確立

溶劑體系的選擇對分離效果至關重要。研究表明,一個好的高速逆流色譜溶劑系統應滿足下列要求:固定相要有較高的保留率;兩相溶劑系統的分層時間小于30 s;分配系數 K 應盡量符合0.5

表1 不同溶劑系統中的分配系數(K)及效果分析Table 1 The partition coefficient(K)values of the targeted components measured in different solvent systems

圖1 荷葉黃酮高速逆流色譜分離圖Fig.1 Determination of flavonoid in lotus leaves by HSCCC注:a的分離體系為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶6∶1∶6; b的分離體系為正丁醇∶甲醇∶水=5∶1∶4。 1、2、3分別為所分離的目標組分C1、C2、C3。

2.2 HPLC分析檢測荷葉黃酮目標組分

利用HPLC對經AB-8大孔樹脂初步純化的荷葉黃酮粗品及經高速逆流色譜技術(HSCCC)分離純化的目標組分進行分析檢測,得到經大孔樹脂純化所得粗黃酮及高速逆流色譜技術(HSCCC)分離純化所得的荷葉黃酮目標組分及標準品的HPLC分析圖如圖2所示。通過標準品對照實驗進行對照,得到3個目標組分分別是紫英云苷、異槲皮苷及槲皮素。

圖2 荷葉黃酮的HPLC檢測圖Fig.2 Determination of flavonoid in lotus leaves by HPLC

2.3 荷葉黃酮目標組分的抗氧化活性研究

2.3.1 荷葉黃酮目標組分對羥基自由基的清除作用 三種目標組分及對照品VC均對羥基自由基有一定的清除作用,在0～1.0 mg/mL濃度范圍內,均隨著濃度的增大而增強,即有一定的劑量效應。VC對羥基自由基的清除率最高,濃度為0.8 mg/mL時,清除率就達到98.01%。目標組分C3在1.0 mg/mL濃度下的清除率可以達到為96.32%。總清除活力有以下順序:VC>C3>C2>C1,與HisashiMatsuda[23]對黃酮結構對抗氧化活性影響的研究結果一致。清除羥基自由基的半數清除率IC50分別為0.63、0.94、0.85、0.76 mg/mL,得到的實驗結果見圖3。

圖3 荷葉黃酮目標組分對羥基自由基的清除率的影響Fig.3 Effects of hydroxyl radical scavenging rate on target components of lotus leaf flavonoids

2.3.2 荷葉黃酮目標組分對DPPH自由基的清除作用 利用DPPH試劑盒對經HSCCC分離所得荷葉黃酮目標組分進行抗氧化研究,以VC作為陽性對照,經HSCCC分離得到三種目標組分及陽性對照VC均對DPPH自由基有一定的清除作用,目標組分C3對DPPH自由基的清除作用最強,在濃度為0.1 mg/mL時已經達到75.42%。在0～1.0 mg/mL濃度范圍內,三種目標組分及陽性對照VC均對DPPH自由基的清除作用均隨著濃度的增大而增強,清除能力大小有以下順序:C3>VC>C2>C1,類似的也有研究指出[24-25],對DPPH自由基的清除能力槲皮素>VC>異槲皮苷。其中VC、C1、C2、C3清除DPPH自由基的半數清除率IC50分別為0.12、0.39、0.28、0.06 mg/mL,得到實驗結果見圖4。

圖4 荷葉黃酮目標組分對DPPH自由基的清除率的影響Fig.4 Effects of DPPH radical scavenging rate on target components of lotus leaf flavonoids

2.3.3 荷葉黃酮目標組分對ABTS+自由基的清除率的影響 利用ABTS試劑對經HSCCC分離所得荷葉黃酮目標組分進行抗氧化研究,以VC作為陽性對照,經HSCCC分離得到三種目標組分及陽性對照VC均對ABTS+自由基有一定的清除作用,VC對ABTS+自由基的清除活性最強,在0.3 mg/mL濃度下清除率就達到了72.63%,而C3在該濃度下僅為52.84%。在0～1.0 mg/mL濃度范圍內,三種目標組分及對照組VC對ABTS+自由基清除能力均隨著濃度的增加而增強。其中對ABTS+自由基清除能力大小VC>C3>C2>C1,有研究表明[26],對ABTS+自由基清除能力中,VC>槲皮素>異槲皮苷。其中VC、C1、C2、C3清除ABTS自由基的半數清除率IC50分別為0.21、0.56、0.47、0.29 mg/mL。得到的實驗結果見圖5。

圖5 荷葉黃酮目標組分對ABTS+自由基的清除率的影響Fig.5 Effects of ABTS+ radical scavenging rate on target components of lotus leaf flavonoids

3 結論

本實驗采用高速逆流色譜法這種較為新穎的分離方法對荷葉黃酮進行分離純化,以80 mg荷葉粗黃酮為原料分離純化得到三種純度較高的荷葉黃酮單體,質量分別為12.4、5.9、2.1 mg。經過標準品對照三種荷葉黃酮可能是:紫英云苷、異槲皮苷及槲皮素。

對所得到荷葉黃酮目標組分進行抗氧化研究,以羥基自由基、DPPH、ABTS+三種自由基機制作為衡量目標組分抗氧化活性的指標。得到三種目標組分對羥基自由基的半數清除率IC50分別為:0.94、0.85、0.76 mg/mL;對DPPH自由基的半數清除率IC50分別為0.39、0.28、0.06 mg/mL;對ABTS+自由基清除率分別為:0.56、0.47、0.29 mg/mL。對荷葉資源的開發與利用提供了一定的技術支持與理論參考。