不同條件對兩株乳酸菌降解生物胺的影響

毛 順,黃笠原,張惠超,李蕊婷,王勇勤,盧士玲

(石河子大學食品學院,新疆石河子 832000)

食品中生物胺的累積呈動態變化主要是由兩類微生物引起的:一類是產氨基酸脫羧酶的微生物,它可以催化氨基酸脫羧形成生物胺;另一類是產生生物胺氧化酶的微生物,它可以通過催化生物胺產生醛,氨和過氧化氫,從而降解已經存在的生物胺。

食品基質往往比較復雜,生物胺除了受微生物影響外,還受很多外部因素影響,如添加物葡萄糖、乳糖、亞硝酸鹽、香辛料等可以減少生物胺的產生[1-2],對食品進行輻照、超高壓處理也可以減少食品中的生物胺[3-5],Nei[6]研究發現,將金槍魚和鯡魚在35 kGyγ-射線照射殺菌處理后,貯藏7 d后沒有發現生物胺的積累,這些方法都是通過降低產胺微生物活性來達到減少生物胺效果的。不同食品在加工過程中的pH、溫度、鹽度、乙醇含量有很大差異。此外,食品中生物胺的量也會影響上述兩種微生物對生物胺的作用。

本研究通過前期從新疆熏馬腸中篩選出來的兩株生物胺氧化酶菌株(植物乳桿菌與唾液乳桿菌),分析了8種不同濃度的生物胺對兩株乳酸菌降解生物胺的影響,以及一些環境因素(pH、溫度、NaCl濃度、乙醇濃度)對兩株乳酸菌降解生物胺性能和生長的影響。以期為該菌株在食品中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),登錄號為KU555358、1株唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),登錄號為KU555364 均為本實驗室篩選;生物胺標準品:色胺、尸胺、苯乙胺、組胺、腐胺、酪胺、精胺、亞精胺 色譜純,美國Sigma公司;甲醇、乙腈 色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;丹磺酰氯 色譜純,美國Sigma公司;MRS培養基 北京奧博星生物試劑公司。

LDZX-40型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;ZHWY-1111型落地普通型大容量恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LC-2010AHT型高效液相色譜儀 日本島津公司;DNP-9272型恒溫培養箱 上海精宏有限公司;KQ-250B型超聲波清洗器 江蘇同君儀器科技有限公司;UB-7型pH計 美國賽多利斯丹佛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相(HPLC)驗證菌種降解生物胺能力

1.2.1.1 生物胺標準溶液的配制 分別配制濃度為1000 μg/mL的組胺、酪胺、苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、精胺和亞精胺生物胺標準儲備液,均用0.4 mol/L的高氯酸將其溶解,并稀釋成50.0、125.0、250.0、500.0、1000.0 μg/mL的生物胺標準溶液。

1.2.1.2 柱前衍生 按照Lu等[7]的方法進行衍生。取1.2.1.1的標準溶液與處理好的樣品處理液各1 mL于5 mL的棕色容量瓶中,加入200 μL的2 mol/L NaOH,搖勻后加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖,然后再加入2 mL的丹磺酰氯溶液(Dns-Cl,10 mg/mL溶于丙酮),搖勻后將其放置于40 ℃的黑暗環境中反應45 min后,加入100 μL的氨水以除去過多的Dns-Cl,最后用乙腈定容至刻度。衍生結束后,用0.22 μm濾膜將其過濾于進樣瓶中。

1.2.1.3 色譜條件 Agilent C18柱(XDB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為水,流動相B為乙腈;流速為0.8 mL/min;進樣量為20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 種子液的制備 將保藏的2株微生物在MRS液體培養基中活化3次后進行平板計數,將活化后的培養液吸取1 mL,逐級稀釋,選取3個合適梯度涂布,于37 ℃條件下培養48 h,將液體培養基放入4 ℃冰箱中。計數后液體培養基稀釋至107CFU/mL,此液體即為種子液。

1.2.3 微生物對單種生物胺的降解作用 分別配制含單種生物胺濃度為100、200、300、400、500、600 μg/mL的MRS培養基,滅菌后,將1.2.2中的種子液各接種1 mL于MRS培養基(9 mL)中,調節pH為6.3,在37 ℃條件下培養48 h,對照組不接種生物胺。取菌懸液2 mL,12000 r/min離心10 min,離心后取1 mL上清液,將1 mL高氯酸(0.4 mol/L)添至上清液中混勻以溶解生物胺作為樣品處理液,之后按1.2.1.2進行衍生化,-20 ℃避光保存、待測。生物胺的降解效果用降解率表示。

式中:W1為不加生物胺的對照組;W2為加了生物胺的樣品組。

1.2.4 溫度對生物胺降解的影響 將1.2.2的菌株種子液接種1 mL到含有8種生物胺各100 μg/mL的液體培養基中,調節pH為6.3,分別在22、27、32、37、42 ℃條件下培養24 h,對照組不接種生物胺。取菌懸液1 mL,逐級稀釋,選取3個合適的梯度涂布,在37 ℃下培養48 h后在MRS固體培養基上做平板計數,其余操作同1.2.3。

1.2.5 pH對生物胺降解的影響 將1.2.2的菌株種子液接種1 mL到含有8種生物胺各100 μg/mL的液體培養基中,分別調節pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,在37 ℃培養24 h,對照組不接種生物胺。其余操作同1.2.4。

1.2.6 NaCl添加量對生物胺降解的影響 將1.2.2的菌株種子液接種1 mL到含有8種生物胺各100 μg/mL的液體培養基中,添加NaCl使其濃度分別為0、2%、4%、6%、8%,調節pH為6.3,在37 ℃培養24 h,對照組不接種生物胺。其余操作同1.2.4。

1.2.7 乙醇對生物胺降解的影響 將1.2.2的菌株種子液接種1 mL到含有8種生物胺各100 μg/mL的液體培養基中,添加乙醇使其濃度分別為0、1.5%、3.0%、4.5%、6.0%,調節pH為6.3,在37 ℃培養24 h,對照組不接種生物胺。其余操作同1.2.4。

1.3 數據處理

試驗數據通過SPSS軟件統計分析,采用Origin 8.5作圖,使用鄧肯式多重比較在5%水平來評估處理樣品之間差異的顯著性,以p<0.05為差異顯著,p>0.05為差異不顯著,以p<0.01為差異極顯著,所有試驗重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 微生物對不同濃度梯度生物胺的降解作用

由表2可以看出,隨著生物胺濃度的增加,兩株菌對生物胺的降解能力先增加再逐漸減少。當生物胺濃度在200～300 μg/mL時兩株菌生物胺降解能力基本達到最大,而當生物胺濃度大于300 μg/mL時兩株菌降解生物胺的能力逐漸減小。植物乳桿菌對色胺的降解能力顯著高于唾液乳桿菌(p<0.05),當胺濃度為300 μg/mL時降解率最大達到41.73%。而在對苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺降解方面,相對于植物乳桿菌,唾液乳桿菌表現出更好的降解能力(p<0.05),對組胺和酪胺的最大降解率可分別達到36.53%和32.13%。

表2 兩株菌對不同濃度梯度生物胺的降解作用Table 2 Two strains on the degradation of biogenic amines in different concentrations of biogenic amines

總的來說,除了在色胺方面是植物乳桿菌表現出較好的降解能力,對于其余生物胺,均是唾液乳桿菌表現出更佳的降解能力。Bartkiene等[8]報道了LactobacillusplantarumZY-40能將鰱魚香腸中腐胺和尸胺的含量降低70%以上,但不影響酪胺的積累。Zhang等[9]研究表明,煙熏前用乳酸菌處理對尸胺、亞精胺的減少具有積極作用,在煙熏后以乳酸菌處理香腸表面,可使香腸外層和中心的腐胺含量顯著降低或完全消除。佟婷婷[10]對四川泡菜中乳酸菌研究表明,LactobacillusplantarumM6能夠高效降解生物胺,其降解作用與sufI基因密切相關,發現sulfI基因表達產物個別位點的差異會使得菌株之間對生物胺的降解能力存在差異,推測這可能是植物乳桿菌和唾液乳桿菌對生物胺降解能力不同的原因,但也不排除其他潛在生物胺降解機制的因素影響。

2.2 溫度對生物胺降解效果的影響

溫度對兩株菌降解生物胺的影響見圖1,可以看出兩株菌都在32～37 ℃范圍內對生物胺有較好的降解效果,偏離這些范圍,降解能力都受到不同程度的抑制。其中植物乳桿菌降解效果最明顯的生物胺是色胺和尸胺,都在37 ℃時達到最佳降解效果,降解率分別為42.55%和36.62%;唾液乳桿菌對組胺和尸胺降解效果最好,在32 ℃時對組胺降解率達到38.63%,而對尸胺的降解效果在32和37 ℃時幾乎一致,降解率分別為33.64%和33.61%。但從整體趨勢來看,唾液乳桿菌的降解效果優于植物乳桿菌,在32～37 ℃范圍內,唾液乳桿菌對生物胺的降解率均超過了16.41%,而植物乳桿菌最低降解率為11.53%。兩株菌均在22 ℃時對生物胺降解效果最差,這可能由兩方面原因造成,一方面是低溫環境降低了微生物活性,另一方面是此溫度下降解生物胺的酶的活性被強烈抑制。相關學者也有類似的報道,如Sugawara等[11]從AspergilluscarbonariusAIU 205提取的3種氧化酶在20 ℃時其活性僅為20%,而在40 ℃時卻可表現出最佳活性。

圖1 溫度對植物乳桿菌(A)和唾液 乳桿菌(B)降解混合生物胺的影響Fig.1 Effects of temperature on the degradation of mixed biogenic amines by Lactobacillus plantarum(A) and Lactobacillus salivarius(B)strains

2.3 pH對生物胺降解效果的影響

初始pH對兩株菌降解生物胺的影響見圖2,可以看出pH對微生物降解生物胺能力的影響隨著pH的增大呈現先增長后下降的趨勢,兩株菌都在pH6.0～7.0的范圍內有良好的降解效果。在pH6.0～6.5的范圍內,植物乳桿菌對除了苯乙胺外的其他胺均有較好的降解效果;在pH6.5～7.0的范圍內,唾液乳桿菌對除了亞精胺外的其他胺均有較好的降解效果。其中植物乳桿菌降解色胺、腐胺、組胺和酪胺的最適pH為6.5,對苯乙胺和尸胺最佳降解pH為6.0,對色胺和尸胺最大降解率分別為42.57%和37.46%。唾液乳桿菌降解組胺、亞精胺的最適pH為6.5,對色胺、苯乙胺、腐胺、酪胺和精胺的最佳降解pH為7.0。對組胺、色胺、腐胺和酪胺的最大降解率分別為37.2%、31.68%、32.44%和32.41%。在pH為5.5和7.5時對大多數生物胺的降解效果都有所降低,這可能是這些pH下微生物和生物胺氧化酶活性受到抑制的緣故。之前有報道表明微生物在偏酸或偏堿的環境中對生物胺的降解能力大幅度降低,如MicrococcusvariansLTH1540降解酪胺的最適pH為7.0～8.0,在pH偏酸和偏堿的環境中,其會喪失對酪胺的降解活性[12];NatrinemagariHDS3-1降解組胺的最適pH為6.5～8.0,在pH為4.0～4.5的酸性環境中喪失降解活性[13],報道的兩株微生物均適宜在偏中性環境中發揮作用,與本研究基本一致。

圖2 初始pH對植物乳桿菌(A) 和唾液乳桿菌(B)降解混合生物胺的影響Fig.2 Effects of initial pH value on the degradation of mixed biogenic amines by Lactobacillus plantarum(A) and Lactobacillus salivarius(B)strains

2.4 NaCl濃度對生物胺降解效果的影響

NaCl濃度對兩株菌降解生物胺的影響見圖3,可以看出兩株菌對生物胺的降解能力隨著NaCl濃度的增加緩慢下降。植物乳桿菌對亞精胺的降解效果在NaCl濃度為2%時達到最大值,降解率為17.44%;對酪胺的降解效果在NaCl濃度為4%時最好,降解率為22.53%;對于其它生物胺,均在NaCl濃度為0%時有較高的降解能力。

圖3 NaCl濃度對植物乳桿菌(A) 和唾液乳桿菌(B)降解混合生物胺的影響 Fig.3 Effects of NaCl concentration on the degradation of mixed biogenic amines by Lactobacillus plantarum(A) and Lactobacillus salivarius(B)strains

整體來看,除了組胺外,在NaCl濃度0～4%范圍內,植物乳桿菌對其它生物胺的降解效果變化都在3%以內,降解率均在15%以上。當NaCl濃度為2%時,唾液乳桿菌對色胺、苯乙胺和尸胺降解效果達到最大值,對腐胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的降解效果在NaCl濃度為0%時最好。同植物乳桿菌一樣,在NaCl濃度0%～4%范圍內唾液乳桿菌對生物胺表現出較高的降解率。當NaCl濃度達到4%時,兩株菌對8種生物胺降解率下降幅度較小,可能是由于在低鹽的濃度范圍內,微生物活性幾乎不受抑制。NaCl在微生物生長中起重要作用,并影響其氨基酸脫羧酶的活性。Gardin等[14]發現,在奶酪中添加5%濃度的NaCl能抑制酪胺和苯乙胺的產生以及生物胺產生菌的生長,但并不是NaCl濃度越高就一定能降低生物胺的含量。當NaCl濃度在5%～20%時,鹽水四聯球菌的組胺產生率大大降低[15]。頭狀葡萄球菌,陰溝腸桿菌和成團泛菌的組氨酸脫羧酶活性也被高濃度NaCl抑制[16-17]。這種現象可歸因于在高濃度NaCl條件下細胞數量降低以及位于細胞膜上的微生物脫羧酶位點受到干擾。作為對比,一項研究[18]報道NaCl增強了從腌漬鳳尾魚中分離的耐鹽葡萄球菌屬組氨酸脫羧酶的活性。因此,可以認為NaCl抑制和刺激生物胺產生的作用是菌株特異性的。以上結果說明兩株菌在低于4%濃度的NaCl的體系中降解生物胺效果最佳,而在NaCl濃度4%～6%的體系中能發揮一定程度的生物胺降解性能。

2.5 乙醇濃度對生物胺降解效果的影響

乙醇濃度對兩株菌降解生物胺的影響見圖4,可以看出兩株菌對生物胺的降解作用隨著乙醇濃度的增加呈快速下降趨勢。

圖4 乙醇濃度對植物乳桿菌(A) 和唾液乳桿菌(B)降解混合生物胺的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on the degradation of mixed biogenic amines by Lactobacillus plantarum(A) and Lactobacillus salivarius(B)strains

在0～1.5%的濃度范圍內,對生物胺的降解能力變化不大;當乙醇濃度達到6%時,對大多數的生物胺的降解能力減少在50%以上,這可能是由于微生物在該乙醇濃度下活性受到抑制,也可能是由于乙醇對生物胺氧化酶產生抑制作用所造成的。乙醇不僅可以抑制生物胺氧化酶活性,還可以增加腸道對生物胺的吸收作用,因此在食用酒精類食品或者和含生物胺食品共同食用時更容易引起生物胺中毒[19-20]。因此,植物乳桿菌和唾液乳桿菌只有在低于1.5%濃度的乙醇體系中才能發揮較好的生物胺降解作用。

2.6 不同外部條件對兩株菌生長的影響

不同外部條件(初始pH、溫度、NaCl濃度和乙醇濃度)對兩株菌生長的影響見圖5。可以看出隨著pH和溫度的變化,微生物數量呈先上升后下降的趨勢,在初始pH為6.0～7.0,溫度27～37 ℃時,微生物擁有較高的活菌數,表明此條件比較適宜微生物生長,同時在此條件下,微生物對生物胺也有較高的降解能力,這一結果與獲得的pH和溫度對生物胺的降解結果一致(圖1和圖2)。Zaman等[21]測定了StaphylococcuscarnosusFS19在不同pH下的活菌數以及對組胺降解能力的變化,發現該菌在pH6.0～8.0的范圍內有較高的活菌數,在5.0～7.0的pH范圍內對組胺降解效果最好。NaCl濃度和乙醇濃度對微生物生長的影響都是隨著其濃度上升微生物數量先緩慢下降后快速下降,這與前面對生物胺降解能力變化的研究一致(圖3和圖4)。唾液乳桿菌在NaCl濃度為2%時活菌數最高,在此條件下該菌對色胺、苯乙胺和尸胺也擁有較高的降解能力。而當NaCl濃度達到4%時,對生物胺降解率變化也加快,說明生物胺的變化與微生物生長密切相關。

圖5 不同外部條件對兩株菌生長的影響Fig.5 Effects of external conditions on the growth of 2 strains

3 結論

通過比較兩株微生物(植物乳桿菌和唾液乳桿菌)在不同濃度梯度下對生物胺的降解效果,當生物胺濃度在200～300 μg/mL時兩株菌生物胺降解能力基本達到最大,而當生物胺濃度大于300 μg/mL時兩株菌降解生物胺的能力逐漸下降。從總體來看,唾液乳桿菌對生物胺的降解效果顯著優于植物乳桿菌(p<0.05)。

研究兩株微生物在不同外部條件下(初始pH、溫度、NaCl濃度和乙醇濃度)對生物胺降解效果以及生長情況得出,植物乳桿菌和唾液乳桿菌分別在pH6.5和7.0時對大多數生物胺具有較高的降解活性;兩株菌均在32～37 ℃范圍內對生物胺有較好的降解效果,并在此最適pH和溫度條件下具有較高的活菌數與較強的生物胺降解能力;當NaCl濃度達到8%,乙醇濃度達到4.5%時,兩株菌對生物胺的降解活性被強烈抑制,同時活菌數也急劇下降。

本研究的結果為肉類加工企業提供了有價值的信息,選擇合適的商業發酵劑,為消費者生產出高質量和更健康的產品。在本研究的基礎上,相對于植物乳桿菌,唾液乳桿菌具有生產出更低生物胺產品的潛能。