野生獼猴桃釀酒酵母的 篩選及其發(fā)酵特性

王榮榮,劉坤峰,朱 靜,*,王夢楠

(1.信陽農(nóng)林學院食品學院,河南信陽 464000; 2.南昌大學食品學院,江西南昌 330031)

野生獼猴桃營養(yǎng)豐富,富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有機物和人體必需的礦物質(zhì),尤其VC含量高達100～420 mg/100 g,被稱為“VC之王”。野生獼猴桃主要分布在大別山山脈、陜西秦嶺山域以及湖南西部等地區(qū)。野生獼猴桃的營養(yǎng)、藥用、保健價值及食用方法備受消費者關(guān)注[1]。由于野生獼猴桃的貯藏期短,目前仍以鮮銷為主,野生獼猴桃深加工利用率明顯不足。

為改善獼猴桃不耐貯藏,尤其是野生獼猴桃資源的浪費現(xiàn)象,開發(fā)野生獼猴桃附加產(chǎn)品對其綜合利用具有重要的意義和開發(fā)前景[2]。近年來,對于野生獼猴桃酒的研究工作主要集中在國內(nèi),羅安偉等[3]和周一琴等[4]從不同品種獼猴桃果實上篩選出3株起酵速度較快的酵母菌株,但利用這些酵母菌株發(fā)酵的野生獼猴桃酒,其不足在于香氣不突出,典型性不強,品質(zhì)不佳,缺乏與其相匹配的先進生產(chǎn)工藝[6]。徐清萍等[5]在野生獼猴桃果實上篩選出發(fā)酵能力強、產(chǎn)香較好及耐受性較強的酵母菌株,但不同地域的野生獼猴桃由于營養(yǎng)成分的差異,篩選出的獼猴桃果酒酵母并不能適應整個國內(nèi)野生獼猴桃酒的生產(chǎn),不同地區(qū)的野生獼猴桃專用酵母的研究還不完善。因此,本研究針對獼猴桃酒生產(chǎn)中缺乏專門的、優(yōu)良的釀酒酵母問題[7],篩選出適合大別山區(qū)獼猴桃酒的釀酒酵母,對提高獼猴桃酒的發(fā)酵速率以及改善獼猴桃酒的品質(zhì)有非常重要的意義。

本試驗擬從大別山區(qū)商城縣采摘的成熟野生獼猴桃果皮中分離篩選出酵母菌種,并進行獼猴桃汁發(fā)酵釀酒和耐受性研究,篩選出產(chǎn)酸、產(chǎn)酒能力、口感均較佳的獼猴桃酒酵母菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生獼猴桃 信陽商城大別山山脈;普通獼猴桃 當?shù)爻校粴溲趸c、偏重亞硫酸鉀 天津市巴斯夫化工有限公司;乙醇 開封市方晶化學試劑有限公司;YEPD培養(yǎng)基、蛋白胨、瓊脂、酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;葡萄糖 天津市大茂化學試劑廠。

SW-CJ-1C型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;SHP-Ⅲ型生化培養(yǎng)箱 上海山連試驗設(shè)備有限責任公司;LDZX-50FA型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;JC303型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海成順儀表有限公司和南通嘉程儀器有限公司合作出品;美澳純釀酒機 MA-A1-159型中山市小欖鎮(zhèn)美澳塑膠制品廠;手持糖度儀 上海眾林機電有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 獼猴桃汁制備 將新鮮的獼猴桃去皮,稱取500 g,切碎打漿,加糖調(diào)節(jié)糖度到21%。將偏重亞硫酸鉀(60 mg/L)(SO2)溶于經(jīng)滅菌過的含有10 mL水的廣口瓶中,加入打漿好的獼猴桃汁液、果膠酶(100 mg/L),封口。在45 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中靜置酶解8 h,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 酵母的分離 將1.2.1中的獼猴桃汁分裝100 mL于已滅菌的250 mL三角瓶中,每個三角瓶加3 g野生獼猴桃果皮(選取不同部位)于28 ℃培養(yǎng)4～5 d。

選取感官判斷帶有明顯酒味且無異味的兩瓶發(fā)酵液[7,14],取1 mL進行10倍系列的稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5),將稀釋液分別取100 μL涂布于YEPD培養(yǎng)基上,每個濃度涂布5個平板,編號,28 ℃培養(yǎng)3 d。挑選形態(tài)不同長勢較好的菌落采用平板劃線法四次純化,獲得單菌落,對其編號后接入YEPD斜面培養(yǎng)基,4 ℃保存?zhèn)溆肹4-5]。

對分離獲得的5株典型酵母(M1～M5),采用WL培養(yǎng)基進行形態(tài)觀察[6],杜氏管進行產(chǎn)氣測定[5]和1.2.1中的獼猴桃汁進行發(fā)酵過程中降糖能力測定(可溶性固形物)。

1.2.3 酵母的釀酒特性

1.2.3.1 酵母耐受性 采用YEPD培養(yǎng)基,調(diào)整SO2、酒精和糖的濃度,按5%(0.65×106cfu/mL)接種M1～M5酵母菌株,于25 ℃發(fā)酵48 h,采用血球計數(shù)板測定發(fā)酵液中的菌體細胞數(shù),不接種酵母的獼猴桃原汁的菌體細胞數(shù)做空白對照,每組3個平行。其中耐SO2的測定:取經(jīng)偏重亞硫酸鉀調(diào)整的SO2濃度為200～350 mg/L的獼猴桃汁;耐酒精能力的測定:取經(jīng)無水乙醇調(diào)整乙醇含量為10%vol～16%vol;耐糖能力的測定:取經(jīng)葡萄糖調(diào)整葡萄糖濃度為200～350 g/L。

1.2.3.2 酵母的發(fā)酵特性 采用1.2.1的方法制備獼猴桃汁,酵母菌(M1～M5)接種量為5%(0.65×106cfu/mL),避光,25 ℃條件下進行初發(fā)酵,每天觀測起泡狀態(tài)、出液情況、獼猴桃果渣的狀態(tài),測其降糖,監(jiān)控發(fā)酵過程。8 d后基本無氣泡產(chǎn)生,果渣下沉,可溶性固形物保持在4 Brix[7],發(fā)酵基本停止,進行酒精度、總酸理化指標的測定,并進行感官評定。

1.2.4 理化指標測定 糖度:手持糖度儀法;酒精度、總酸參照GB/T 15038-2006測定;VC含量的測定:2,6-二氯酚靛酚法[8]。

1.2.5 酵母菌產(chǎn)氣測定 分離得到的酵母菌株接入杜氏小管中,28 ℃培養(yǎng),在不同時間段測定其產(chǎn)氣情況[9]。

1.2.6 感官評定 由10位經(jīng)驗豐富,具有專業(yè)知識的人員組成感官評定小組對產(chǎn)品進行感官評定。獼猴桃酒的感官評定標準如表1所示,參照孫洪浩[10]的方法,略微修改。

表1 獼猴桃酒發(fā)酵液的感官評價標準Table 1 Kiwi wine fermented liquid of sensory evaluation standard

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

2.1.1 酵母形態(tài)觀察 通過顯微鏡觀察和WL的初步篩選,得到多端出芽、菌落顏色為奶油色(淺黃色)至綠色,表面為球形突起光滑,不透明,奶油狀的菌株有5株,分別編號為M1～M5。菌落形態(tài)如表2和圖1所示,M1～M5菌株都是奶白色或淺綠色或深綠色,圓形或橢圓形。

表2 酵母菌落形態(tài)Table 2 The colonial morphology of yeast

圖1 酵母菌落形態(tài)Fig.1 The colonial morphology of yeast

2.1.2 酵母的發(fā)酵力 酵母菌在不同時間段產(chǎn)氣情況結(jié)果如表3所示。有3株酵母菌產(chǎn)氣較明顯,分別是M2、M4和M5,其中M2、M4和M5所產(chǎn)氣體充滿整個杜氏管,這些產(chǎn)氣能力強的酵母極可能主發(fā)酵力強,但后續(xù)還需根據(jù)其他實驗結(jié)果確定最適酵母菌株。

表3 杜氏小管發(fā)酵情況Table 3 The fermentation of duchenne tubules

發(fā)酵是在無氧條件下,酵母菌分解可溶性固形物等有機物,產(chǎn)生酒精和CO2的過程。而降糖速度,即可溶性固形物分解速度反映了目標菌株的發(fā)酵能力[7,11]。M1～M5號菌株發(fā)酵果酒過程中,可溶性固形物的變化曲線如圖2所示。其中M2的降糖能力最強,M5次之,M3在前3 d降糖高于M4和M1外,但后期其降糖能力較這兩株菌有所降低。

圖2 可溶性固形物含量變化Fig.2 The content changes of soluble solid

2.2 酵母的釀酒特性

2.2.1 酵母耐受性

2.2.1.1 酒精耐受性測定 耐酒精能力強的酵母可使發(fā)酵更徹底,顯著提高果酒的酒精度。酒精達到一定濃度會抑制酵母菌的生長,過高濃度的酒精使酵母菌中毒致死[12]。

不同酵母對不同酒精度的耐受性(10%vol～16%vol)如圖3所示。酒精度在10%vol～12%vol范圍內(nèi),這5株酵母生長狀況良好,其中M2和M5耐受性更強。酒精濃度14%vol～16%vol范圍內(nèi),酒精度對5株酵母的生長均有很大程度的抑制,隨著酒精度的增加,抑制作用更強。在10%vol～12%vol時,耐受性依次為M5>M2>M4>M3>M1,M5總體酒精耐受性較好,M1和M3較差。

圖3 酵母在不同酒精濃度時YEPD培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth of yeast in YEPD medium under different alcohol concentrations

2.2.1.2 糖耐受性測定 糖是酵母發(fā)酵的底物,是轉(zhuǎn)化為酒精的主要來源,也為酵母提供能源物質(zhì)。適宜的糖濃度可使酵母的代謝更旺盛,但高濃度糖對酵母有抑制作用。因而,優(yōu)良的酵母應對高糖濃度產(chǎn)生的滲透壓具有較好的耐受性[13]。

不同酵母對不同糖濃度的耐受性如圖4所示。糖濃度200～300 g/L時,5株酵母的生長狀況良好,但當濃度升高至350 g/L時,酵母的生長均受到不同程度的抑制。M1、M2和M5在300 g/L的糖濃度時生長情況良好,有較好的耐受性。

圖4 酵母在不同糖濃度時YEPD培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Growth of yeast in YEPD medium under different glucose concentrations

2.2.1.3 SO2耐受性測定 SO2的添加既能抑制有害微生物,又能防止果汁被氧化,但其對酵母會產(chǎn)生脅迫作用,從而影響發(fā)酵程度[14]。

酵母在不同濃度(200～350 mg/L)的生長情況見圖5。SO2濃度在200～250 mg/L時,5株酵母的生長基本不受抑制;300～350 mg/L時,對5株酵母的生長均有明顯的抑制作用。其中M2和M5能耐受300 mg/L的SO2。

圖5 酵母在不同SO2濃度時YEPD培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 Growth of yeast in YEPD medium under different SO2 concentrations

2.2.2 酵母的發(fā)酵特性

2.2.2.1 果酒發(fā)酵狀態(tài)觀察 獼猴桃酒發(fā)酵過程中發(fā)酵狀態(tài)如果肉的狀態(tài)、發(fā)酵液澄清度、起泡產(chǎn)量等可反應酵母菌的發(fā)酵速度,即發(fā)酵力。發(fā)酵過程觀察5 d(發(fā)酵旺盛期)和8 d(發(fā)酵基本終止)的果酒發(fā)酵狀態(tài)如圖6和表4所示。M2和M5果肉上浮較快,發(fā)酵液澄清度較高,分層明顯,因此發(fā)酵速度較快。

表4 發(fā)酵第5、8 d發(fā)酵情況記錄結(jié)果Table 4 States of fermentation of kiwi wine(fermented after 5,8 days)

圖6 第5 d(a)和8 d(b)獼猴桃酒的發(fā)酵狀態(tài)Fig.6 States of fermentation of kiwi wine at 5 days(a)and 9 days(b)

2.2.2.2 獼猴桃酒特性 酒精度、酸度是評判獼猴桃酒酵母菌株發(fā)酵效果的重要指標,酵母菌株需在較短時間達到一定的產(chǎn)酒量(獼猴桃酒的最佳酒精度在8%vol～13%vol),而酸度過高會使獼猴桃酒口感不愉悅,酸度過低則使口感趨于平淡[15-16],獼猴桃干酒成品的酸度通常為0.4～0.8 mg/100 mL(以檸檬酸計)[17]。

測定不同菌株發(fā)酵8 d后的酒精度、總酸和VC含量如表5所示。其中M2的酒精度最高為10.9%vol,M3的酒精度最小為8.3%vol,酒精度轉(zhuǎn)化未見較大差距。M2總酸最高為0.9 g/100 mL,M1、M3和M4總酸較低為0.6 g/100 mL。VC含量差異不大,其中M5釀造的果酒VC含量最高。

表5 不同菌株發(fā)酵的獼猴桃酒指標Table 5 Indicators of kiwi wine fermented by different strains

2.2.2.3 獼猴桃酒的感官評價 果酒作為飲品,外觀和口感對于產(chǎn)品非常重要,發(fā)酵過程中的泡沫多少對于工業(yè)生產(chǎn)亦有較大影響,大量泡沫對工業(yè)生產(chǎn)很不利[16]。因此野生獼猴桃專用酵母應該使發(fā)酵液具有澄清透明、光澤好等特點,且口感良好。本試驗對獼猴桃酒的澄清度、光澤、香味、色澤和口感五個方面作出評分,評分結(jié)果如表6所示。

表6 獼猴桃酒的感官評鑒Table 6 Sensory evaluation of Kiwi wine

由表6可看出,M1發(fā)酵液不澄清,光澤度差,香味一般,且口感平淡;M4有異雜味;M3發(fā)酵液澄清,但不具有獼猴桃典型風味;而M2和M5發(fā)酵液口感適中,具有獼猴桃典型風味,但M2澄清度和光澤方面略遜于M5。

綜合上述結(jié)果,M5產(chǎn)氣能力良好,其降糖能力僅次于M2,能夠耐受14%vol的酒精度,而M2耐受酒精的能力較差,M5可耐受300 g/L的糖和300 mg/L SO2,其釀造的獼猴桃酒8 d時,酒精度僅次于M2,綜合發(fā)酵狀態(tài)和感官評鑒結(jié)果,M5最適合發(fā)酵獼猴桃酒。周一琴等[4]從獼猴桃表面篩選出一株能夠耐受SO2濃度27.5 mg/L、酒精度可達9.8%vol產(chǎn)香能力好的菌株X7-1。本文M5菌株在SO2耐受性方面較X7-1好。蔣成等[18]篩選的菌株L36,能夠耐受酒精體積分數(shù)14%,SO2質(zhì)量濃度250 mg/kg,發(fā)酵15 d酒精度可達10.56%。M5在發(fā)酵產(chǎn)酒精的時間方面優(yōu)于L36,M5作為釀酒菌種,能在短時間內(nèi)達到一定產(chǎn)酒量,其產(chǎn)酒力較好,能夠達到一般果酒酒精度(9%vol～12%vol)的要求,所以M5符合工業(yè)化生產(chǎn)菌株的要求。

3 結(jié)論

通過發(fā)酵過程觀察、感官評價及理化指標測定結(jié)果分析,確定M5菌株為最佳獼猴桃釀酒酵母。M5菌株用于發(fā)酵獼猴桃酒,發(fā)酵速度快、酒液澄清、降糖能力較強,所得獼猴桃酒酒液清澈,口感酸甜適中,具有獼猴桃典型的清雅、和諧的果香及酒香,有純凈柔和、酸甜適中、果香味濃的特點,無異雜味。

試驗所篩選出的M5菌株發(fā)酵所得的果酒酸度為0.8 g/100 mL,酒精度9.8%Vol;并且感官品質(zhì)極佳。而徐清萍等[5]篩選出的YM-7菌株發(fā)酵果酒的酒精度為10.7%Vol,酸度2.33 g/100 mL,酒液呈淺黃色,果香酒香濃郁,但果酒酸度高,口感酸澀。相比較而言,M5菌株酸度適中,但產(chǎn)酒精量略低于YM-7菌株。此外,M5菌株的發(fā)酵耐受性較好。后續(xù)要增強M5菌體發(fā)酵獼猴桃酒香氣方面的研究。綜上,M5菌株經(jīng)過后期馴化有望發(fā)展為優(yōu)良獼猴桃釀酒酵母。