果膠酶處理對甜玉米芯 可溶性糖含量的影響

王 鑫,黎晨晨,吳媛媛,謝靜南,馬永強

(哈爾濱商業大學,食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

甜玉米又被稱為蔬菜玉米,為禾本科,玉米屬,因其營養豐富,味道香甜、鮮脆爽嫩,含大量人體所必需的氨基酸、蛋白質、糖類以及維生素而受到消費者的青睞[1]。玉米芯是指玉米果穗脫去子粒后剩余的部分,又稱玉米穗軸,一般可占玉米穗20%～30%左右[2],玉米芯除了小部分用作糠醛[3]、發酵底料、木糖醇[4]等產品的原料外,大部分作為農家燃料被燒掉,對甜玉米芯的利用更是微乎其微,造成很大的浪費,現階段玉米芯多用于制糖。其中的果膠質(C6H16O5)n廣泛存在于高等植物中,其直鏈狀,由D-半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷鍵連接而成,是植物細胞質的組成物質,能夠促使鄰近的細胞壁相連[5]。主要包括原果膠(Protopectin)、果膠酸(Pectic acid)、果膠酯酸(Pectinic acid)、果膠(Pectin)。果膠酶是指能夠催化果膠質分解的多種酶的總稱[6],通過裂解或消去作用切斷果膠質中的糖苷鍵,使果膠質裂解為多聚半乳糖醛酸。果膠的水解度即果膠水解后得到的D-半乳糖醛酸的含量與水解前甜玉米芯中果膠含量的比值。水解是木質纖維素資源開發利用的關鍵步驟之一[7-8],按其過程可分為酸水解和酶水解兩種。

目前關于玉米芯可溶性糖提取的研究常見的預處理方法有物理機械法、堿法、酸法、酶法以及蒸汽爆破法,使甜玉米芯內部結構變得疏松、削弱木質纖維素的結構。黃仁亮等[9]采用氨水方法進行玉米芯的預處理,但結果僅有部分的木質素溶在氨水中,效果并不好;郭長慧等[10]采用稀酸-蒸煮預處理,木糖得率較高,說明能很好地破壞木質素-纖維素結構,使其變得疏松,有利于提取。王瓊等[11]用高溫液態水預處理與超馬來酸水解相結合的方法提高了玉米芯的水解率。Bender等[12]認為，蒸汽噴爆法是從植物原料中提取半纖維素的最佳方法,而目前關于玉米芯可溶性糖含量的研究較少。

本實驗以酸處理玉米芯對其內部結構進行了破壞,并結合果膠酶處理進一步提高總可溶性糖的產率。探討甜玉米芯經酸預處理后的果膠酶最佳處理條件，對甜玉米芯具有一定的實際價值與意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國脆王甜玉米 黑龍江盛昌農產品加工有限公司;D-半乳糖醛酸 色譜純,日本和光純藥工業株式會社;3,5-二硝基水楊酸 化學純,河南致勝化工有限公司;果膠酶 蘇柯漢生物制劑有限公司;果膠粉 三門峽富元果膠工業有限公司;濃硫酸、葡萄糖 中國醫藥上海化學試劑公司;硫代硫酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;硼酸、石油醚 天津市天新精細化工開發中心;檸檬酸、檸檬酸鈉 哈爾濱市新春化工廠;蒽酮 濟南中澤化工有限公司;碘化鉀 天津市大茂化學試劑廠,均為分析純;DNS試劑 實驗室自制。

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;TGL-16G-B型臺式高速離心機 閩南星科科學儀器有限公司;H198/28型pH計測試筆 北京海星順達經銷公司;HYP-1008型消化爐 上海纖檢儀器有限公司;721E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;TGL-16G-B型離心機 星科離心機;FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜玉米芯的預處理 將甜玉米芯切割成邊長為1.5～2.0 cm方塊狀,60 ℃干燥后粉粹過120目篩,得到甜玉米芯粉未進行后續實驗。

1.2.2 果膠含量的測定 果膠的含量采用重量法進行測定[14]。準確稱取2.50 g粉碎后甜玉米芯粉于100 mL的燒杯中,加入30 mL,2% Na2CO3溶液(用0.16% NaOH為溶劑進行配制),于50 ℃的恒溫水浴鍋中水浴加熱20 min,水浴過程中不斷攪拌,水浴結束后放入離心機,以5000 r/min的轉速離心20 min,分離上清液,將上清液倒入燒杯中,再往有沉淀的離心管中加入10 mL蒸餾水,混勻并再次離心,條件同上,重復2次,將全部上清液合并到燒杯中,進行果膠酸沉淀。向盛有上清液的燒杯中加入1 mL冰醋酸酸化溶液,再加入2 mL的25% CaCl2溶液,混勻,放置電爐上加熱至沸騰并不斷攪拌,沸騰后取下溶液冷卻至室溫,10 min后,以5000 r/min的轉速離心20 min,倒掉上清液收集沉淀,將沉淀用10 mL的0.1%醋酸沖洗并再次離心(同上),反復5次。將所得到的沉淀放入烘干箱中烘干(105 ℃)至恒重,稱量,同時作3組平行樣品測定,計算果膠含量。

式(1)

式中:m1-果膠酸鈣及培養皿的質量(g);m-甜玉米芯的質量(g);m2-培養皿的質量(g);0.9235-由果膠酸鈣換算為果膠的系數。

1.2.3 果膠酶酶活的測定 按照《果膠酶制劑酶活測定》(QB 1502-1992)進行測定[15]。

1.2.4 甜玉米芯處理液的制備 稱取甜玉米芯粉末5.00 g于250 mL碘量瓶中,加入蒸餾水150 mL,5 mol/L鹽酸100 mL,于110 ℃水浴下提取35 min,進行酸水解,冷卻至室溫,備用。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 添加量對果膠水解度的影響 分別取9 mL pH3.5的甜玉米芯處理液至試管中,向其加入50、63、76、89、102、115 U/g的果膠酶液在50 ℃水浴120 min后10 min滅酶,冷卻、離心(3000 r/min,5 min),測定溶液中D-半乳糖醛酸的含量,計算果膠水解度。

1.2.5.2 溫度對果膠水解度的影響 分別取9 mL pH3.5的甜玉米芯處理液至試管中,加入量為89 U/g的果膠酶,在45、50、55、60、65、70 ℃中處理120 min后10 min滅酶,冷卻、離心(3000 r/min,5 min),測定溶液中D-半乳糖醛酸的含量,計算果膠水解度。

1.2.5.3 pH對果膠酶水解度的影響 分別取9 mL pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0甜玉米芯處理液至試管中,果膠酶的添加量為89 U/g,在50 ℃中處理120 min后10 min滅酶,冷卻、離心(3000 r/min,5 min),測定溶液中D-半乳糖醛酸的含量,計算果膠水解度。

1.2.5.4 處理時間對果膠酶水解度的影響 分別取9 mL pH3.5的甜玉米芯處理液至試管中,添加果膠酶,在50 ℃水浴中分別處理30、60、90、120、150、180 min,10 min滅酶后,冷卻、離心(3000 r/min,5 min),測定溶液中D-半乳糖醛酸的含量,計算果膠水解度。

1.2.5.5 果膠水解度測定方法 以3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[13]測定的D-半乳糖醛酸量記為m1(mg),得到的回歸方程為y=0.5414x-0.072,R2=0.9991。采用重量法[14]測定的果膠量記為A(%),計算一定量玉米芯m2(g)中的果膠水解度。

式(2)

1.2.6 響應曲面優化試驗 根據果膠酶處理甜玉米芯的單因素實驗結果,選擇主要因素和適宜的水平進行響應面實驗設計[12],見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平及編碼Table 1 Factor levels and coding of Box-Behnken experimental design

1.2.7 果膠酶處理前后可溶性糖含量的測定

1.2.7.1 未用果膠酶處理甜玉米芯其可溶性糖含量的測定 稱取經過預處理的甜玉米芯0.50 g于50 mL三角瓶中,加水15 mL,5 mol/L鹽酸10 mL后在110 ℃條件下蒸煮處理一定的時間,冷卻后用35% NaOH溶液中和,然后用蒸餾水定容至100 mL,過濾,取濾液10 mL,再用蒸餾水定容100 mL,成稀釋1000倍的總糖水解液。以葡萄糖為標準品,用蒽酮比色法測量吸光度值,得到的標準曲線回歸方程為y=0.2857x+0.0086,R2=0.9954,由公式(3)計算總可溶性糖的含量,作3組平行樣品測定。

式(3)

式中:m1-蒸煮后溶液中可溶性糖的含量(mg);m2-稱取的甜玉米芯的質量(g)。

1.2.7.2 果膠酶法處理甜玉米芯其可溶性糖含量的測定 稱取經過預處理的甜玉米芯0.50 g于50 mL三角瓶中,加水15 mL,5 mol/L鹽酸10 mL后在110 ℃條件下蒸煮處理一定的時間,冷卻后,吸取9 mL pH=5.0的甜玉米芯處理液至比色管中,向其加入89 U/g的果膠酶液1 mL,在60 ℃水浴鍋中水浴90 min后于沸水中滅酶10 min,冷卻至室溫,再用冷卻后用35% NaOH溶液中和,然后用蒸餾水定容至100 mL,過濾,取濾液10 mL,再用蒸餾水定容100 mL,成稀釋1000倍的總糖水解液,用蒽酮比色法測量吸光度值,由公式(4)計算總可溶性糖的含量。作3組平行樣品測定[8]。

式(4)

式中:m3-果膠酶處理后溶液中總可溶性糖的含量(g);m4-甜玉米芯的質量(g)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 果膠含量及果膠酶活力的測定

由平行實驗數據可知,甜玉米芯中的果膠含量為3.69%±0.78%,酶活為(5940.75±198.03) U/g。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對甜玉米芯果膠水解度的影響 從圖1看出,酶添加量為50～89 U/g時，隨著酶添加量的增加,D-半乳糖醛酸溶出量也隨之增加,但由于底物的濃度不變,當酶添加量提高到89 U/g之后,D-半乳糖醛酸溶出量呈下降趨勢。這可能是由于過低的酶添加量使果膠分解不完全,而過高的酶添加量使溶液中的半纖維素含量升高,粘度增大,從而使D-半乳糖醛酸溶出，傳質過程減慢,導致溶出量的下降[17-18]。所以酶添加量在89 U/g左右比較適宜。

圖1 酶添加量對甜玉米芯果膠水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on pectin hydrolysis degree of sweet corncob

2.2.2 溫度對甜玉米芯果膠水解度的影響 從圖2看出,在45～60 ℃之間，隨著溫度的升高,D-半乳糖醛酸隨著增加,溫度達到60 ℃后,D-半乳糖醛酸反而降低?？赡苁怯捎诠z酶酶結構遭到破壞,影響其水解效果;溫度過低時,果膠酶酶活受抑制,水解不充分[19],同時,當溫度超過65 ℃時可能使果膠酶失活,而且可能會引起果膠絮凝沉淀,所以濕度為60 ℃較適合。

圖2 溫度對甜玉米芯果膠水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on pectin hydrolysis degree of sweet corncob

2.2.3 pH對甜玉米芯果膠水解度的影響 從圖3中所知,果膠酶在3.5～5.5的pH范圍內,酶分子具有較高活性,且不溶性果膠能夠最大限度的分解。過高或者過低,可能是對果膠的穩定性會產生一定的影響[19],所以選擇pH為5.0時為適宜。

圖3 pH對甜玉米芯果膠水解度的影響Fig.3 Effect of pH on pectin hydrolysis degree of sweet corncob

2.2.4 時間對甜玉米芯果膠水解度的影響 由圖4可知,時間與果膠酶水解效果呈同步上升趨勢,在時間達到90 min時,果膠酶水解充分,之后趨于穩定狀態。由于處理液底物不變,酶添加量不變,理論上時間延長，產物得率應趨于平衡狀態,但是在試驗過程中,當時間越長,D-半乳糖醛酸的量呈緩慢下降趨勢,參考楊書艷等[20]采用酸法提取玉米芯的預處理試驗,可知酶解時間越長,酶活降低越快[21],D-半乳糖醛酸還原,90 min后果膠的水解度變化不大,所以果膠酶的水解時間設定為90 min。

圖4 時間對甜玉米芯果膠水解度的影響Fig.4 Effect of time on pectin hydrolysis degree of sweet corncob

2.3 響應曲面優化試驗

依據Design Expert軟件設計的29組方案進行試驗,結果見表2。經數據分析得到果膠水解度的多元二次回歸方程模型為:

表2 實驗設計與結果表Table 2 Experimental design and results

表3 響應面模型方差分析表Table 3 Response surface model variance analysis

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression equation

2.4 響應曲面分析

響應曲面圖和等高線圖可以直觀地反映出各因素之間的交互作用,從而確定其對響應值的影響。曲面越呈現陡峭,表明該因素對相應值的影響越顯著[22]。由圖5～圖10可知,加酶量、溫度、pH、時間對果膠水解度的交互影響效應,曲面呈現山丘狀有最佳值,均存在極值。等高線呈橢圓形,且橢圓的軸線與坐標軸之間的有較大的角度,各因素之間有一定的交互作用但不顯著,所以優化方程時可去除相應交互項[23]。從三維空間點到底面的投影可得到橢圓形等高線圖,試驗最優條件處在圓心處。在酶添加量87.98 U/g,溫度為59.80 ℃時,酶解時間為98.87 min,pH為4.99時,陡峭程度高,達到最高點[24-26]。經過響應曲面優化試驗,得理論上水解度達最大值的條件:酶添加量87.98 U/g,酶解溫度59.80 ℃,pH4.99,酶解時間98.87 min,此時果膠水解度的預測值為43.84%±0.01%。

圖5 酶添加量和溫度對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.5 Interactive effect between enzyme addition and temperature on pectin hydrolysis degree

圖6 酶添加量和pH對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.6 Interactive effect between enzyme addition and pH on pectin hydrolysis degree

圖7 酶添加量和時間對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.7 Interactive effect between enzyme addition and time on pectin hydrolysis degree

圖8 溫度和pH對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.8 Interactive effect between temperature and pH on pectin hydrolysis degree

圖9 溫度和時間對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.9 Interactive effect between temperature and time on pectin hydrolysis degree

圖10 時間和pH對果膠水解度的等高線圖和響應曲面Fig.10 Interactive effect between time and pH on pectin hydrolysis degree

2.5 驗證實驗

根據響應曲面的優化結果結合實際條件,得到優化后的最佳實驗條件酶添加量88 U/g,溫度60 ℃,pH5.0,酶解時間90 min,進行驗證試驗。平行實驗3組,得到果膠水解度為43.82%±0.02%,與果膠水解度預測值相差較小,表明響應曲面優化的工藝條件可行。

2.6 果膠酶處理甜玉米芯前后對其可溶性糖含量測定的結果與分析

通過果膠酶處理,甜玉米芯中的可溶性糖含量提高,由53.16%±0.02%提高到62.89%±0.03%,提高了9.73%。

3 結論

通過果膠酶處理甜玉米芯的單因素實驗以及響應曲面優化試驗,確定最終優化條件為酶添加量88 U/g,酶解溫度60 ℃,pH5.0,酶解時間90 min。此時果膠的水解度可以達到最大值43.82%±0.02%。采用酸加果膠酶處理甜玉米芯的可溶性糖產率較單一酸處理的53.16%±0.02%提高了9.73%,達到62.89%±0.03%,此結果為提高可溶性糖含量的實驗方法做出一定理論依據。