應用MiSeq測序分析自然發酵豆醬醬塊中 微生物的多樣性

姜 靜,解夢汐,安飛宇,武俊瑞,唐筱揚,烏日娜

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

豆醬是一種傳統的發酵豆制品,在中國作為調味劑已有幾個世紀之久,在日本被稱為Miso(味噌)[1],在韓國則叫做Doenjang[2]。作為一種傳統的發酵食品,豆醬具有自己獨特的色、香、味、形,長期以來深受我國各地人們的喜愛[3]。除此之外,豆醬中還含有許多對人體有益的生理活性物質,具有一定的保健功能[4],如抑制血清膽固醇、抑制脂肪肝的形成,預防肝細胞癌[5-6],抑制血管緊張素轉化酶[7],降血壓、清除放射性物質和抗癌[8-10]等。

傳統發酵豆醬的生產過程主要分為兩個階段,前制曲階段和后發酵階段[11],其中制曲是影響豆醬產品質量的重要工藝[12],本身具有非常復雜的微生物生態系統,而這些微生物負責水解醬塊發酵過程中的主要成分,包括蛋白質、脂肪和碳水化合物等,從而產生各種代謝產物,例如氨基酸、有機酸、活性代謝產物和苷元,對豆醬的營養、口感、風味和功能具有重要作用[13]。目前,工業制曲大多數廠家添加米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)[14]。然而,添加單一菌種制曲使得豆醬的風味和口感遠不如傳統發酵豆醬。因此,研究傳統發酵豆醬醬塊中微生物多樣性是十分重要的。

當前,豆醬制品釀制過程中的主要微生物可分為三大群體,即霉菌、細菌和酵母菌[15]。Lee等[16]采用DGGE技術分析豆醬中的微生物,發現豆醬中主要細菌是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis),主要真菌是傘枝犁頭霉菌(Absidiacorymbifera)、曲霉菌(Aspergillus)、假絲酵母菌(Candida);田甜[17]利用焦磷酸測序技術對東北豆醬自然發酵過程中微生物進行分析,結果表明,優勢細菌為葡萄球菌屬(Staphylococcus)和明串球菌屬(Leuconostoc),優勢真菌為赤霉菌屬(Gibberella)、擬青霉屬(Paecilomyces)和青霉菌屬(Penicillium)。

近年來,隨著基因測序技術的不斷進步,越來越多的研究者利用Miseq第二代測序技術分析復雜環境微生物。相對于傳統的純培養法和第一代測序技術或酶切法,Miseq測序技術不僅可以產生測序覆蓋深度更大的數據量，而且可以發現低豐度的細菌菌群。通過MiSeq測序技術分析傳統發酵豆醬醬塊中的微生物多樣性,深入了解傳統發酵豆醬醬塊微生物群落結構,挖掘豐富的微生物資源并確定醬塊中優勢菌群,為工業化人工接種法生產醬類提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6份成熟醬塊樣品 采集于沈陽胡臺不同農家,編號分別為HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6,采集的樣品于-20 ℃保存。

Eppendorf5417高速冷凍離心機 德國艾本德公司;Agilent 2100生物分析儀 美國Agilent公司;MiSeq測序儀 美國Illumina公司;Qubit 2.0核酸蛋白定量儀 美國Carlsbad公司;MetaVxTM試劑盒 美國Genewiz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 pH7.0、濃度為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮8 g醬塊樣品,加入玻璃珠,振蕩器振蕩3 min;收集上清液棄去沉淀,洗滌三次;10000 r/min高速離心5 min,取上清液,得到菌體;收集的菌體用pH7.0、濃度為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮,9000 r/min 5 min,洗滌三次;洗凈的菌體懸浮在磷酸鹽緩沖液中,用槍吹打后渦旋振蕩均勻。采用Fast Prep結合CTAB法進行總DNA的快速提取[18]。

1.2.2 MetaVxTM文庫構建和Illumina MiSeq測序 以30～50 ngDNA為模板,PCR引物擴增原核生物16S rDNA上V3/V4區,擴增體系為20 uL,4 uL 5*FastPfu緩沖液,2 uL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 uL引物(5 umol/L),0.4 uLFastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。反應參數:預變性條件為95 ℃,3 min;循環為95 ℃,30 s、55 ℃,30 s、72 ℃,30 s,27個循環;最后在72 ℃下延伸,10 min,4 ℃保存。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴增V3和V4區,采用包含“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”序列的上游引物和包含“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”序列的下游引物擴增V4和V5區。另外,通過PCR向16S rDNA的PCR產物末端加上帶有Index的接頭,以便進行NGS測序。

使用生物分析儀檢測文庫質量,并且通過核酸蛋白定量儀檢測文庫濃度。DNA文庫混合后,按測序儀器使用說明書進行2×300 bp雙端測序(PE),由MiSeq自帶的MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息。

1.2.3 ITS區文庫構建和 Illumina MiSeq 測序 以50～100 ng DNA為模板,PCR擴增真菌ITS區。采用包含“ACCTGCGGARGGAT”序列的上游引物和包含“GAGATCCRTTGYTRAA”序列的下游引物擴增ITS1區,采用包含“GTGAATCATCGARTC”序列的上游引物和包含“TCCTCCGCTTATTGAT”序列的下游引物擴增ITS2區。再通過PCR向ITS區的PCR產物末端加上帶有Index的接頭,以便進行NGS測序。

1.3 數據分析

Miseq測序結果為雙端測序得到的正反向reads首先進行兩兩組裝連接,過濾拼接結果中含有N 的序列,保留序列長度大于200 bp的序列。經過質量過濾,去除嵌合體序列,最終得到的序列用于OTU分析,使用VSEARCH(1.9.6)進行序列聚類(序列相似性設為 97%),比對的16S rRNA和18S rRNA參考數據庫是Silva 119。然后用RDP classifier貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析,并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成。基于OTU的分析結果,采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法,分別計算 Shannon、Chao等α多樣性指數,并作出稀釋曲線。通過 PCA分析比較樣本的微生物群落間是否有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 樣品測序數據

如表1所示,不同農家醬塊中真菌和細菌菌群α-多樣性分析。可操作分類單元(OTU)是指根據某一人為設定的序列相似度閾值,將來自一個或多個樣本的序列進行歸并,彼此間相似度高于該閾值的序列都將歸并為一個OTU;物種豐富度指數(ACE)是用來估計群落中含有OTU數目的指數;辛普森多樣性指數(Simpson)是用來定量的描述一個區域的生物多樣性;趙氏指數(Chao)是反映樣品中群落的豐富度;香農指數(Shannon)用來估計樣品中微生物多樣性;覆蓋率(Coverage)是指各樣本文庫的覆蓋率,其數值越高,則樣本中序列沒有被檢測出的概率越低。

表1 每個樣本的多樣性指數Table 1 Diversity estimates for each sample

測序6個樣本ACE多樣性指數變化范圍在22～34.5之間,Simpson指數變化范圍在0.03～0.79,各樣品的Shannon指數變化范圍在0.14～2.87,Chao指數變化范圍在22～33,表中97%的物種型的樣本文庫覆蓋率為1,這表明樣品中菌群型基本被鑒定出來。

2.2 稀釋曲線

采用對測序序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線,即稀釋性曲線,如圖1、圖2所示。

圖1 細菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve analysis of bacteria

圖2 真菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve analysis of fungi

每個樣品的取樣深度,從6份樣品中隨機抽取的測序條數如圖1橫軸所示,縱軸則表示基于該測序條數能構建的OUT數量,在<6000條序列時,OTU值隨著序列增加而迅速增加;在>6000條序列時,OTU數增加緩慢,曲線趨于平坦時,說明測序數據量合理,更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小。該分析是基于OTU序列差異水平在0.03即相似度97%的水平上進行運算的。

2.3 樣品中細菌群落組成分析

采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并在門和屬水平上統計每個樣品的群落組成。

從圖3細菌在門水平上的分布來看,6份樣品中共檢測出4個已知的細菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和藍藻菌門(Cyanobacteria),其中優勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes),所占比例在81.9%～99.9%之間。

圖3 細菌在門水平群落結構Fig.3 Bacterial community structure at phylum level

如圖4所示,從細菌在屬水平的分布來看,6份樣品共檢測出23個已知屬。其中主要細菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)和明串珠菌屬(Leuconostoc),但在各個樣品中,優勢菌屬存在顯著差異。例如,樣品HT3(73%)、HT5(47.8%)中優勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus);樣品HT1(55%)、HT6(53.1%)優勢菌屬為腸球菌屬(Enterococcus);樣品HT4(40.8%)優勢菌群是明串株菌屬(Leuconostoc);樣品HT2(41.2%)優勢菌屬為肉桿菌屬(Carnobacterium)。

圖4 細菌在屬水平群落結構Fig.4 Bacterial community structure at genus level

明串珠菌(Leuconostoc)是革蘭氏陽性、耐氧的一種乳酸細菌,是美國FDA公認的安全菌株(GRAS),是韓國泡菜發酵過程中起主要作用的微生物[19]。Nam等[20]在韓國大醬中檢測出腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)和L. sp. HBB8。在正常情況下,腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)產乳酸,可以在高鹽和高糖環境中生長[21]。在本研究中,明串珠菌(Leuconostoc)存在于除HT1以外所有樣品中,可以推測明串珠菌(Leuconostoc)應該是醬塊中的主要細菌之一,對豆醬的發酵可能起重要作用。

乳桿菌(Lactobacillus)存在于所有樣品中(HT1<0.02%),是HT3和HT5的優勢菌種。武俊瑞等[22]初步推斷嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是黑龍江傳統發酵豆醬中優勢乳酸菌菌群。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)廣泛存在于醬油和豆醬中,它是FDA批準使用的乳酸菌[23]。由于醬塊是自然發酵豆醬發酵過程中的重要來源之一,所以有理由認為醬塊中的乳桿菌主要是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)可以降解雜醇為組氨酸、精氨酸和天冬氨酸,對豆醬風味有著重要作用。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)不僅有利于食品發酵,改善風味,提高營養價值,而且作為益生菌存在于人體內對人體具有有益的調節作用,如改善腸道功能、抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化、降低膽固醇、降低亞硝酸鹽[24-25]。

醬塊中腸球菌(Enterococcus)是相對豐富的細菌菌群,在本研究中,腸球菌(Enterococcus)存在于所有樣品中,且半數樣品中腸球菌(Enterococcus)所占比例超過27.1%。Jeong等[26]發現在醬塊發酵過程中,隨著芽孢桿菌(Bacillus)數量增多腸球菌(Enterococcus)數量降低。事實上,樣品HT1和HT6中腸球菌(Enterococcus)分別占55%和53.1%,而芽孢桿菌分別占0.02%和0.04%,這個可以解釋為腸球菌(Enterococcus)在豆醬發酵過程中起重要作用,它可以阻止某些細菌例如芽孢桿菌(Bacillus)的生長[27]。

2.4 樣品中真菌群落組成分析

如圖5真菌在門水平上的分布來看,6份樣品已知真菌主要包括子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。在當前的研究中,6份樣品中子囊菌門(Ascomycota)均占主導地位,所占比例在50.8%～99.9%之間。

圖5 真菌在門水平群落結構Fig.5 Fungi community structure at phylum level

真菌在屬水平分類,如圖6所示,6份樣品歸屬于13個已知屬。主要檢測出來的真菌有青霉菌屬(Penicillium)、念珠菌屬(Candida)、毛霉菌屬(Mucor)等,但各個樣品間優勢菌群存在差異。樣品HT1、HT3、HT6中優勢真菌為青霉菌(Penicillium、78.7%～97%);樣品HT2優勢菌群是念珠菌(Candida,61.1%);樣品HT4、HT5占比較高的菌群均是尚未分類菌群。

圖6 真菌在屬水平群落結構Fig.6 Fungi community structure at genus level

真菌在豆醬發酵過程起重要作用,它可以將大分子營養物質降解為小分子[28]。目前對醬塊中細菌的研究非常多,但對真菌菌群的研究相對較少。Hong等[29]對韓國醬塊中菌群進行研究,發現曲霉菌(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)、帚霉菌(Scopulariopsis)等為韓國醬塊中的主要真菌。Jung等[30]對傳統韓國醬塊中微生物群落動態進行了分析,發現在整個發酵過程中,主要檢測出來的真菌為地絲菌屬(Geotrichum)、帚菌屬(Scopulariopsis)、紅曲霉屬(Monascus)、鐮刀菌屬(Fusarium)和曲霉屬(Aspergillus)。而在本研究中,青霉菌(Penicillium)和毛霉菌(Mucor)存在于所有樣品中,是樣品中的優勢菌群。由于溫度和水分等是影響真菌群落的重要因素,所以醬塊中真菌群落組成會有差異。

2.5 主成分分析

PCA作為一種無監督的分析方法,反映數據的原始狀態,觀察試驗樣品的自然分布和組別關系[31]。本研究對6份醬塊真菌和細菌進行了PCA分析,如圖7所示(細菌主成分得分圖),利用各樣品序列間的進化信息計算樣品距離,觀察6份不同醬塊樣品多樣性差異,其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)可以解釋59.93%的原變量信息。PCA分析中有些站點聚在一起,有些距離相對較遠,故可將6份樣品細菌群落大致分為3組:組1為樣品HT1、HT3、HT5、HT6;組2 為樣品HT2;組3為樣品HT4,表明大多數樣品細菌菌群之間存在密切的聯系。因此可以看出,同一地區制作的醬塊,絕大多數細菌群落仍具有緊密聯系。

圖7 細菌主成分得分圖Fig.7 Bacterial PCA scoring diagram

如圖8所示(真菌主成分得分圖),第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)可以解釋66.39%的原變量信息。PCA得分圖顯示將6份醬塊樣品真菌群落大致分為3組:組1為樣品HT1、HT2、HT3、HT5;組2為樣品 HT4;組3為HT6。其中HT1、HT2、HT3、HT5顯示真菌之間有密切的聯系,說明真菌群落在同一地區制作的醬塊中變化不顯著。

3 結論與討論

在本研究中,利用Miseq測序技術對采自中國遼寧胡臺不同農家的6份醬塊微生物群落結構進行分析。結果表明,在門水平上,優勢細菌為厚壁菌門(Firmicutes),真菌為子囊菌門(Ascomycota);在屬水平上,主要細菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc),主要真菌為青霉菌屬(Penicillium)和毛霉屬(Mucor)。

張穎等[32]通過PCR-DGGE技術結合微生物多樣性測序方法分析豆醬發酵過程中細菌的多樣性,結果表明,腸球菌屬(Enterococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為豆醬樣品不同發酵階段的優勢細菌菌屬。韓國學者Kim[33]利用454焦磷酸測序對韓國豆醬細菌菌群進行分析,結果表明韓國豆醬主要細菌是乳酸菌,包括嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)、腸球菌(Enterococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳桿菌(Lactobacillus)。在本研究中,乳酸菌中除嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)外,其他優勢細菌基本符合上述研究。嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)是豆醬中的主要乳酸菌,但有趣的是,先前運用分子生物學方法均沒有在醬塊中發現嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)[34],豆醬的制作就是將醬塊和鹽水按一定比例混合,發酵成為豆醬。因此可以猜測,嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)存在于混合過程中的鹽水中或者在醬塊中處于休眠狀態且含量極低。

劉春鳳等[18]利用基因克隆文庫構建技術對發酵成熟醬醅微生物進行分析,主要真菌為接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、Rhizochaete屬、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)。韓國學者Hong等[35]利用免培養法檢測韓國醬塊中的真菌,發現曲霉菌(Aspergillus)、帚霉菌(Scopulariopsis)、毛霉菌(Mucor)和青霉菌(Penicillium)為韓國醬塊中的主要真菌。本研究中的優勢菌群為青霉菌(Penicillium)和毛霉菌(Mucor),由于醬塊中的水分和發酵時的溫度是決定真菌菌群的重要因素,所以不同地區、不同手法制作的醬塊,優勢菌群之間存在差別。

本文中除了真菌和細菌的優勢菌群外,其余大多數是占比重小于1%的群落參與醬塊的發酵,它們占總菌群種類的80%以上。雖然不能解釋這些占比重小于1%的微生物是如何與優勢菌群相互作用,但這些微生物可能在維持微生物群落穩定上起重要作用,在適當的條件下,它們有潛力成為主要的微生物來源[20]。因此,醬塊不僅由幾個主要微生物種群組成,還包括許多占比重小的微生物群落。