青海牧區(qū)產凝乳酶細菌多樣性分析

朱 艷,羅俏俏,馬 江,楊 敏,文鵬程,張忠明,朱建寧,賀曉玲,張衛(wèi)兵,*

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農業(yè)大學理學院,甘肅蘭州 730070; 3.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局,甘肅蘭州 730000)

凝乳酶是奶酪生產中的關鍵酶,奶酪加工工程中凝乳酶具有切斷κ-酪蛋白特定肽鍵的功能,能使牛乳中的酪蛋白凝結[1];奶酪成熟過程中，凝乳酶可將酪蛋白分解為大分子多肽,并進一步降解成氨基酸、胺、含硫化合物等風味物質[2]。根據(jù)來源不同，凝乳酶可分為動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。不同來源的凝乳酶性質不同,動物凝乳酶在干酪生產中應用最早,但由于原料缺乏,導致其價格昂貴[3]。植物凝乳酶由于蛋白水解力強,制成的干酪有一定苦味,限制了其應用[2]。微生物凝乳酶主要來源于細菌、真菌和少數(shù)放線菌,由于微生物資源豐富、種類多,因而可以用其生產出多種性能不同的凝乳酶。目前缺乏微生物凝乳酶的生產技術和菌種,因此產凝乳酶微生物的研究成為凝乳酶研究的熱點[3-5]。

細菌是產凝乳酶微生物的重要種類,目前國內外已發(fā)現(xiàn)了多種產凝乳酶的細菌,但大多酶活不高[6-8]。青藏高原地區(qū)海拔高、空氣稀薄、晝夜溫差大、輻射強度大,特殊的地理、氣候條件造就了豐富、獨特的微生物種質資源[9]。近年來人們對于該地區(qū)微生物資源進行了大量研究,獲得了產纖維素酶、木聚糖和纖溶酶的微生物[10-13],但關于該地區(qū)產凝乳酶微生物的系統(tǒng)性報道較少。

本研究擬從青海牧區(qū)廣泛采集樣品,研究產凝乳酶細菌資源和細菌凝乳酶的多樣性,以揭示該地區(qū)產凝乳酶細菌的特異性,為青藏高原地區(qū)微生物多樣性及種質資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 36個,于2016年7月至9月,從青海海南、海西、海北等地牧區(qū)牧場、牦牛飲水區(qū)和擠奶區(qū)在離地面5～10 cm左右采集土樣,放入滅菌的紙袋中于4 ℃保存?zhèn)溆?牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、氯化鈉、氯化鈣、瓊脂粉、福林 蘭州嘉特星化學試劑公司;麩皮 蘭州市安寧區(qū)桃海市場;脫脂奶粉 黑龍江完達山乳業(yè)股份公司;細菌總基因組DNA提取試劑盒 美國Omega公司;DL2000 DNA Marker 大連Takara公司;試驗所用引物 上海派森諾生物科技股份有限公司;酪蛋白固體培養(yǎng)基:蛋白胨2.5 g/L,葡萄糖10 g/L,酵母膏1 g/L,干酪素10 g/L,脫脂牛乳50 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;酪蛋白液體培養(yǎng)基不加瓊脂;斜面培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;麩皮汁培養(yǎng)基:將10 g麩皮加入100 mL自來水,煮沸10 min,四層紗布過濾后用補足100 mL,pH自然;脫脂乳培養(yǎng)基∶脫脂乳與水以1∶8的比例配制,115 ℃滅菌10～15 min。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;DHG-9033BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;H1650R型冷凍高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種初篩 稱取1 g的土壤樣品于99 mL無菌生理鹽水,分別稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個稀釋度,取1 mL涂布于酪蛋白固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)48 h,選擇沉淀圈與菌落直徑比值大的菌落進一步劃線分離,分離純化后接入新鮮斜面培養(yǎng)基保藏,以備菌種復篩。

1.2.2 菌種復篩 將菌種分別接種于麩皮汁培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min轉速搖床培養(yǎng)48 h,取培養(yǎng)液于4000 r/min,4 ℃下離心10 min,取上清液測凝乳酶活力和蛋白水解活力。

1.2.3 酶活測定 凝乳酶活力的測定采用Arima法[14];蛋白酶活力測定方法采用福林法[15]。

1.2.4 基因組DNA提取 將復篩后分離菌株分別接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng),用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA,具體操作流程按操作說明進行。

1.2.5 16S rDNA 擴增 采用細菌通用引物27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492r:TACGGC TACCTTGTTACGACTT,使用16S rDNA Bacterial Identification PCR儀,進行PCR擴增目的片段。反應體系共50 μL,94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,30個循環(huán),72 ℃保溫5 min。取反應產物5 μL上樣,1%瓊脂糖凝膠電泳,于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.6 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析 切膠回收目的片斷由上海派森諾生物科技股份有限公司完成DNA測序,將測定的16S rDNA序列在NCBI使用Blast與GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對,選擇與其相似度高的菌株的序列,使用ClustalX 1.8對齊后利用軟件MEGA4.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 產凝乳酶細菌的種群多樣性分析 參考蘭曉君等[16]的方法。定義16S rRNA基因序列同源性大于97% 作為同一分類單元,分別計算Shannon指數(shù)(D)、Simpson指數(shù)(H)、Shannon-Wiener均勻度指數(shù)(E)和Margalef豐富度指數(shù)(Ma)。

式(1)

Simpson指數(shù)=1-∑Pi2

式(2)

Shannon-Wiener均勻度指數(shù)=H/log2S

式(3)

Margalef豐富度指數(shù)Ma=(S-1)/lnN

式(4)

式中,ni表示第i種的菌株數(shù);N表示所有菌株數(shù);S為菌種數(shù);Pi=ni/N,表示第i種的相對多度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中各組數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值,以平均值±標準差表示;數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩

36個樣品中共分離得到21株有明顯沉淀圈的細菌菌株,劃線分離純化后編號分別為HN1、HN2、HN3、HN4、GL1、GL2、GL3、GL4、HB1、HB2、HB3、HB4、HX1、HX2、HX3、HX4、HM1、HM2、HM3、HM4、HM5。21個菌株菌落直徑、水解圈直徑及沉淀圈直徑結果如表1所示。

表1 不同菌株在酪蛋白平板上水解圈和沉淀圈直徑(mm)Table 1 Diameter of hydrolyze and deposition circles on the solid casein medium of different strains

沉淀圈和水解圈直徑是產凝乳酶細菌初篩時常用的檢測指標,水解圈直徑的大小與菌株蛋白水解活力有一定的關系,水解圈直徑越大,蛋白水解活力越大;沉淀圈直徑的大小與菌株凝乳酶活力有一定的關系,沉淀圈直徑越大,凝乳酶活力越大;但由于固體平板和液體培養(yǎng)的條件不同,菌株在液體發(fā)酵的產酶情況不一致[15]。由表1可以看出,不同菌株的菌落直徑、水解圈直徑及沉淀圈直徑有一定差異,說明這些菌株的凝乳酶活和蛋白水解力有一定的差異;菌株HN1菌落直徑最小,為2.0 mm,而沉淀圈直徑達到11.0 mm,沉淀圈與菌落直徑比值達到5.5,說明其凝乳酶活力可能較高;該菌株的水解圈直徑為3.0 mm,沉淀圈與水解圈直徑比值達到3.6,說明其凝乳酶活力與蛋白水解力的比值可能較高。菌株HM2菌落直徑最大,達到5.3 mm,而沉淀圈直徑為7.5 mm,沉淀圈與菌落直徑比值僅為1.41,說明其凝乳酶活力可能較低;該菌株的水解圈直徑為1.3 mm,沉淀圈與水解圈直徑比值達到5.7,說明其凝乳酶活力與蛋白水解力的比值可能較高。其余菌株的菌落都介于這兩株菌之間,其沉淀圈與菌落直徑比值也介于1.41～5.5之間。

2.2 菌種復篩

21株菌株在不同培養(yǎng)基中的兩種酶活性見表2。

表2 不同菌株在不同培養(yǎng)基中的產酶活力Table 2 Enzyme activities of different strains in different fermentation medium

表2可以看出不同菌株在不同培養(yǎng)基中凝乳酶活力和蛋白水解力極大差異,顯示營養(yǎng)成分對產酶特性有一定影響。在21株菌在脫脂乳培養(yǎng)基中的凝乳酶活力介于8.9～29.5 SU/mL,蛋白水解力介于6.9～61.8 U/mL之間;在酪蛋白培養(yǎng)基中的凝乳酶活力在6.1～30.5 SU/mL之間,蛋白水解力在4.1～56.7 U/mL之間;在麩皮汁培養(yǎng)基中的凝乳酶活力在11.3～1215.6 SU/mL之間,蛋白水解力介于14.6～59.5 U/mL之間;菌株HN 1在麩皮汁培養(yǎng)基中發(fā)酵時,凝乳活力最高,可以達到1215.6 SU/mL,對應的蛋白水解活力為14.6U/mL,凝乳活力與蛋白水解力比值達到83.26,說明其發(fā)酵液中凝乳酶活力高,有利于干酪的制作[15]。

2.3 16S rDNA 序列相似性分析

不同菌株PCR擴增產物電泳圖見圖1。

圖1 不同菌株的16S rDNA序列的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of RCR amplification product of 16s rDNA of different stains注：1～21:菌株編號,依次與表2中的菌株對應。

圖1為不同菌株16S rRNA PCR擴增產物電泳圖,結果與表3吻合。由表3可以看出,14株桿菌中,菌株HN3與BacilluscereusLAM 30的16S rDNA序列相似性在98%以上,其余菌株與其最相近的典型菌株的相似性均在99%以上,根據(jù)分子生物學鑒定的依據(jù),這14株桿菌都屬于芽孢桿菌屬。其中菌株HN2鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus),菌株HX1和GL1鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),菌株HN4鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis),菌株GL3和GL4鑒定為堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus),菌株HB1和HB2鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium);菌株HN1和HB3鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),菌株HM2鑒定為韋氏芽孢桿菌(Bacillusweihenstephanensis),菌株HM1鑒定為蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides),菌株HX4鑒定為簡單芽胞桿菌(Bacillussimplex);7株球菌中菌株HM3、HX3和HX2鑒定為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis),菌株HB4和GL2鑒定為黃色黏球菌(Myxococcusxanthus),菌株HM4鑒定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis),菌株HM5鑒定為藤黃微球菌(Micrococcusluteusstrain)。

表3 不同菌株的16S rDNA序列相似性分析Table 3 Similarity analysis of partial 16S rDNA sequences of different strains

同時,由表3還可以看出,21株菌分別屬于3個門,其中厚壁菌門(Firmicutes)有18株,占到85.7%,變形菌門(Proteobacteria)有2株,占到9.5%,放線菌門(Actinobacteria)1株,占到4.7%。從屬水平上看,21株菌中有14株菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),占到總菌株的66.67%,說明芽孢桿菌是產凝乳酶細菌中的優(yōu)勢屬;腸球菌屬(Enterococcus)有3株菌,占到14.2%,為第二優(yōu)勢屬;黏球菌屬(Myxococcus)有2株菌,占到9.5%;乳球菌屬(Lactococcus)和微球菌屬(Micrococcus)均只有1株菌,僅占4.5%。

由圖2可以看出,相同屬的菌株聚集在一個分支上,不同屬的菌株遺傳距離較遠;14株桿菌的親緣關系較近,7株球菌的親緣關系較近,球菌和桿菌的親緣關系較遠,與表3的分析結果一致。

圖2 產凝乳酶細菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of homology

2.4 產凝乳酶細菌的多樣性分析

辛普森多樣性指數(shù)(D)、Shannon-Wiener指數(shù)(H)、Shannon-Wiener均勻度指數(shù)(E)和Margalef豐富度指數(shù)(Ma)用于表示群落中物種的多樣性和豐富度。本試驗中產凝乳酶細菌的多樣性和豐富度指數(shù)的結果見表4,4個指數(shù)分別為0.916、3.053、0.802、4.269,辛普森多樣性指數(shù)(D)、Shannon-Wiener指數(shù)(H)和Shannon-Wiener均勻度指數(shù)(E)均大于蘭曉君等對金川鎳礦可培養(yǎng)細菌的多樣性的對應指數(shù)[16],說明該地區(qū)的產凝乳酶細菌種類的多樣性和豐富度較高。與文獻中報道的土壤細菌多樣性相比[17],本試驗中的多樣性較低,這是因為產凝乳酶的細菌只是樣品中所有細菌的一部分。

表4 產凝乳酶細菌多樣性指數(shù)Table 4 Diversity of bacteria producing milk-clotting enzymes

3 結論與討論

國外細菌凝乳酶研究19世紀初就開始,最早報道的產凝乳酶細菌為多粘芽孢桿菌[3]。此后先后報道地衣芽孢桿菌[4]、枯草芽孢桿菌[5-7]、球形芽孢桿菌[8,18]、納豆芽孢桿菌[19]、黃色粘球菌[20]、糞腸球菌[21]等產凝乳酶。國內凝乳酶研究起步較晚,從20世紀80年代末才開始凝乳酶的研究工作,郭光遠[22]等首先從160株細菌中篩選到14個產凝乳酶菌株;此后,周俊清等研究者分別報道了產凝乳酶的蠟狀芽孢桿菌[23]、枯草芽孢桿菌[24-25]和地衣芽孢桿菌[15]。本試驗從青海牧區(qū)采集的土壤樣品中分離篩選到21株產凝乳酶細菌,其中有14株菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),說明芽孢桿菌是產凝乳酶細菌中的優(yōu)勢屬,這一結果與國內外已有的報道基本一致。

從已有的文獻來看,由于篩選時采用選擇性培養(yǎng)基和產酶培養(yǎng)基不同,因而篩選得到菌株種類和性能有所差異;來自乳制品及其加工環(huán)境中的樣品中分離到的菌株較多,不同來源的樣品中可能會有不同種類的菌株[4-8]。青藏高原地區(qū)放牧歷史悠久,當?shù)啬撩耖L期利用牦牛奶、馬奶和羊奶加工酸奶、曲拉、酥油等乳制品,因而該地區(qū)富集了大量的乳品微生物資源。本試驗的結果證明了該地區(qū)的乳品加工環(huán)境中存在豐富的產凝乳酶微生物。另外,本試驗中發(fā)現(xiàn)的產凝乳酶的Bacillusthuringiensis、Bacillusfirmus、Bacillusweihenstephanensis、Bacillusmycoides、Lactococcuslactis、Micrococcusluteus等以前均未報道,說明了青海牧區(qū)土壤中的產凝乳酶細菌有一定的特異性。在后續(xù)試驗中,如果加大樣品的采集量,可能會分離篩選出更多種類，并且性能優(yōu)良的產凝乳酶細菌。

本文得到的21株菌在脫脂乳培養(yǎng)基中的凝乳酶活力介于8.9～29.5 SU/mL,在酪蛋白培養(yǎng)基中的凝乳酶活力介于6.1～30.5 SU/mL,在麩皮汁培養(yǎng)基中的凝乳酶活力介于11.3～1215.6 SU/mL,說明菌種的種類和營養(yǎng)成分對其產酶特性都有一定的影響,這與本試驗室以前的結果一致[15,27-28]。這一結果也表明菌株篩選時盡可能選用多種培養(yǎng)基,以免漏掉一些產酶能力較高的菌株。本試驗中得到的菌株HN1在麩皮汁培養(yǎng)基中發(fā)酵時,凝乳活力最高,可以達到1215.6 SU/mL,比以往報道的細菌菌株的凝乳酶活力都高,說該菌株有應用于工業(yè)化生產的潛力。