不同肌纖維走向下牛肉剪切力的差異

劉晶晶,萬紅兵,豐永紅,張松山,雷元華,謝 鵬,李海鵬,孫寶忠

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100000)

不同的加工過程形成不同的嫩度特性。影響嫩度的因素有很多,目前認為肌纖維、結(jié)締組織、肌內(nèi)脂肪是影響牛肉嫩度的最重要因素[1]。不同的烹飪方式,加熱溫度與時間的不同都會對牛肉品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響[2]。郎玉苗[6]研究發(fā)現(xiàn),肌纖維走向?qū)εＨ饧羟辛τ兄@著影響,平行于肌纖維走向的剪切力顯著低于垂直于肌纖維走向。導(dǎo)致該差異的原因尚且未知,肌纖維和結(jié)締組織是影響牛肉嫩度的最重要因素,結(jié)締組織的主要存在形式肌內(nèi)膜和肌束膜是由鑲嵌在蛋白多糖基質(zhì)中膠原蛋白和彈性纖維構(gòu)成的復(fù)合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的[7]。Lewis G J[5]研究發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)膜和肌纖維膜的性質(zhì)相似,但二者變性溫度不同。根據(jù)Bernal and Stanley[4]研究報道，牛肉嫩度與肌束膜的機械強度有關(guān)。L Christensen[3]認為膠原蛋白分子不同程度的共價交聯(lián)造成結(jié)締組織耐熱強度不同。一些研究認為，隨著動物年齡的增長,牛肉嫩度降低、剪切力增加的原因有很多,其中包括膠原蛋白的含量以及肌束膜厚度[8-9]。I. Girard等認為肌原纖維和肌束膜、肌內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)完整性是影響熟肉嫩度的主要原因[10]，說明牛肉嫩度是肌纖維與結(jié)締組織共同作用的結(jié)果。據(jù)Lewis[11]研究報道，將肉切成很薄的片狀,順著肌纖維方向切割的力量主要是由肌內(nèi)膜-肌外膜聯(lián)合主導(dǎo),順肌纖維方向切割一定厚度的肉塊時,結(jié)締組織中的肌內(nèi)膜肌外膜形成的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有很高的強度,切割時無疑會需要更大的力。由此推測牛肉的剪切力大小與其幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)。

本實驗針對中國消費者的飲食習慣研究肌纖維走向?qū)εＨ馐秤闷焚|(zhì)的影響,以使牛肉生產(chǎn)和加工滿足中國消費者的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛半腱肌 選自同一育肥場、品種和飼養(yǎng)管理相同的河南夏南牛6頭,24月齡。屠宰后牛半胴體在4 ℃冷庫中成熟48 h后進行取樣,從半胴體上取下整條左側(cè)半腱肌,所選胴體其大理石花紋、生理成熟度和背標厚度等指標基本相似。真空包裝,-20 ℃貯運。

濃硫酸、一水檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、正丙醇、異丙醇、氯胺T、對二甲基氨基苯甲醛、4-羥基-α-吡咯甲酸、戊二醛、乙醇、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺 分析純,國藥集團化學試劑北京有限公司。

TA-XT plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;6100型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;TGL16MB高速冷凍離心機 湘智離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 加熱處理 取凍存肉樣,在4 ℃條件下解凍24 h,去除肉塊表面的皮下脂肪和肌外膜,切割成大小為2.5×5.0×5.0 cm的肉塊若干并稱重,分組,用蒸煮袋包裝,分別在不同溫度(60、70、80、90、100 ℃)水浴鍋中加熱,分別加熱30、60、90、120、150 min,當達到規(guī)定時間后,立即取出,流水冷卻至室溫,用吸水紙吸干肉塊表面汁液,稱重,待分析。

1.2.2 剪切力值測定 取直徑為1.27 cm的圓柱形空心取樣器沿垂直于肌纖維方向和平行于肌纖維方向各取5個長條肉柱,使用TA.XY Plus物性測試儀的HDP/BS刀具進行檢測,使長條肉柱較長邊與刀口運動方向垂直,進而測定剪切力值。

1.2.3 質(zhì)構(gòu)剖面分析 取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的肉丁按肌纖維垂直和肌纖維平行于托板的方向放置,以二次壓縮模式進行質(zhì)地剖面分析。對硬度、彈性、凝聚性、黏著性、膠黏性、咀嚼性和回彈性等7個指標進行測定。

質(zhì)構(gòu)分析參數(shù)設(shè)定如下:

測前速度:2.00 mm·s-1,測試速度:1.00 mm·s-1,測后速度:1.00 mm·s-1,壓縮率:50%,兩次壓縮間隔時間:5.0 s,觸發(fā)力:0.98 N,活塞:P/50,溫度:20 ℃,數(shù)據(jù)獲取率:200 PPS。

1.2.4 肌內(nèi)結(jié)締組織機械強度測定 結(jié)締組織機械強度測定按照Nishimura[12]的方法,取1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm肉柱,用2.5%戊二醛溶液固定三天,之后在10%NaOH溶液中浸泡5 d(每天換水2次),之后再在蒸餾水中浸泡5 d(每天換水兩次),用乙醇除去肌束膜的脂肪,蒸餾水沖洗去除乙醇,最后將樣品浸入7.5%丙烯酰胺(含過硫酸銨(1.5 mg/mL),立即加入TEMED(0.75 μL/mL)聚合3 h,用質(zhì)構(gòu)儀檢測丙烯酰胺包埋的結(jié)締組織機械強度。

1.2.5 羥賴氨酸吡啶啉HP和賴氨酸吡啶林LP的測定 用預(yù)冷的PBS(0.1 mol·L-1,pH=7.4)沖洗組織,稱重后將組織剪碎,將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨,最后將勻漿液于5000×g離心5～10 min,取上清檢測。從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出板條,設(shè)置標準品孔和樣品孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL,樣品孔中加入待測樣本50 μL,空白孔不加,除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物(HPR)標記的檢測抗體100 μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37 ℃恒溫箱溫育60 min,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min,每孔加入終止液50 μL,15 min內(nèi),在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.2.6 掃描電鏡觀察 將所制備好的肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉柱,于2.5%戊二醛中4 ℃固定3 d,然后用磷酸緩沖液(PBS)(pH7.4)清洗3次,每次30 min;用50%、70%、80%和90%的乙醇梯度脫水各15 min,100%乙醇脫水3次,每次30 min;樣品脫水后,用叔丁醇置換3次,每次30 min;置換后的樣品直接移到樣品臺上,冷凍干燥,隨后用離子濺射儀給樣品表面鍍一層金屬膜(10 nm),掃描電子顯微鏡(SEM)在電壓為15.0 kV下放大500倍觀察肌束膜和肌內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,處理組之間差異顯著性分析采用鄧肯氏多重比較法,數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”的表示方法,相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中心溫度下不同肌纖維方向剪切力的變化

圖1表示不同中心溫度不同肌纖維方向下剪切力的變化。隨著中心溫度的升高,垂直于肌纖維方向與平行于肌纖維方向的剪切力在60～90 ℃呈上升趨勢,當中心溫度上升至100 ℃時剪切力均有所下降。加熱至相同中心溫度的牛肉平行肌纖維方向的剪切力顯著低于垂直方向(p<0.05),隨著中心溫度的升高,平行肌纖維方向的剪切力依然顯著低于對應(yīng)中心溫度的垂直于肌纖維方向的剪切力(p<0.05)。JA Boles[15]研究得出垂直于肌纖維方向的剪切力比平行于肌纖維方向的高50%。

圖1 不同中心溫度不同肌纖維方向下牛肉剪切力的變化Fig.1 Effects of different central temperatures on the shearing force of beef注:不同大寫字母代表相同溫度不同肌纖維走向剪切力 差異顯著(p<0.05),不同小寫字母代表不同溫度 相同肌纖維走向剪切力差異顯著(p<0.05)。

2.2 不同加熱時間下不同肌纖維方向剪切力的變化

圖2反映的是不同加熱溫度時間下不同肌纖維走向的剪切力,從圖中可以看到，隨著加熱時間的延長,牛肉剪切力整體呈現(xiàn)下降趨勢。相同加熱溫度時間下不同肌纖維走向的剪切力差異均顯著,平行于肌纖維方向的剪切力顯著低于垂直于肌纖維方向(p<0.05)。

圖2 不同肌纖維方向下剪切力的變化Fig.2 Changes of shear force in different fiber directions注:不同大寫字母代表相同溫度相同加熱時間不同肌纖維 走向差異顯著(p<0.05)。圖3、圖5同。

2.3 不同肌纖維走向牛肉質(zhì)構(gòu)特性的變化

圖3是牛半腱肌在60、80、100 ℃下加熱30、60、90、120、150 min,分別對其按照垂直于肌纖維方向和平行于肌纖維方向進行質(zhì)地剖面分析后得出的結(jié)果。從圖3中可以看出,相同加熱溫度與時間下,平行于肌纖維方向的牛肉硬度、凝聚性均顯著低于垂直于肌纖維方向(p<0.05),不同肌纖維走向下彈性、黏著性、膠黏性、咀嚼性有一定差異，表明不同肌纖維方向?qū)∪獾馁|(zhì)構(gòu)特性有一定影響,硬度、黏著性與咀嚼性都與肌肉剪切力密切相關(guān),說明牛肉嫩度與質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)。

圖3 不同肌纖維走向?qū)εＨ赓|(zhì)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of different fiber directions on the texture of beef

2.4 不同肌纖維走向結(jié)締組織機械強度的變化

由圖4可以看到,牛半腱肌肉結(jié)締組織機械強度隨著加熱時間的延長呈3階段變化,在30～60 min,機械強度無顯著變化(p>0.05);在60 ℃和100 ℃下，加熱90～120 min,機械強度顯著增加(p<0.05)；在80 ℃下，加熱60～90 min，機械強度顯著增加(p<0.05);120～150 min,機械強度顯著降低(p<0.05),垂直于肌纖維方向的結(jié)締組織機械強度顯著高于平行于肌纖維方向(p<0.05),且變化趨勢一致。

圖4 不同肌纖維方向下牛肉結(jié)締組織機械強度的變化Fig.4 Changes in connective tissue mechanical strength in different fiber directions注:不同大寫字母表示不同肌纖維方向結(jié)締組織機械強度 差異顯著(p<0.05),不同小寫字母表示延長 加熱時間結(jié)締組織機械強度差異顯著(p<0.05)。

2.5 不同加熱時間下膠原蛋白共價交聯(lián)的變化情況

圖5反映了不同加熱時間下膠原蛋白共價交聯(lián)的變化。圖5A反映的是不同加熱溫度下延長加熱時間羥賴氨酸吡啶啉(HP)的變化情況,圖5B反映的是賴氨酸吡啶啉(LP)的變化情況。

從圖5可以看出,各個溫度下,隨著加熱時間的延長,羥賴氨酸吡啶啉的含量呈上升趨勢,賴氨酸吡啶啉的含量大體呈下降趨勢。牛肉在70、80、100 ℃下延長加熱時間,羥賴氨酸吡啶啉HP的含量呈現(xiàn)部分組內(nèi)差異顯著(p<0.05);賴氨酸吡啶啉LP的含量在60、70、90 ℃下呈現(xiàn)部分組內(nèi)差異顯著(p<0.05)。說明加熱溫度與時間對牛肉共價交聯(lián)量有明顯影響。

圖5 不同加熱時間下膠原蛋白共價交聯(lián)的變化Fig.5 Changes in collagen cross-linkig under different heating time

2.6 掃描電鏡觀察

Krystyna Palka[16]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織的粒化發(fā)生在60 ℃,溫度越高,粒化越嚴重。圖6分別是60、100 ℃下，延長加熱時間肌肉橫縱截面的掃描照片,從圖6中可以看到，不同溫度不同時間下結(jié)締組織的變化情況,結(jié)締組織的破損情況比肌纖維嚴重得多。隨著加熱的進行,可以看到肌束膜收縮,肌纖維束間空隙變大。隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長,各肌纖維之間空隙持續(xù)增大,肌內(nèi)膜的完整性完全破壞,各肌纖維連接松散,從縱截面也可以看到單根肌纖維斷裂,肌內(nèi)膜破碎呈絲狀。

圖6 不同肌纖維方向牛肉微觀結(jié)構(gòu)變化(500×)Fig.6 Micro-structural changes of beef in different fiber directions(500×)

圖6是按照垂直于肌纖維方向和平行于肌纖維方向切割肉樣后對其截面進行掃描電鏡觀察,從圖片中可以看到,沿著垂直于肌纖維方向切割牛肉時,肌纖維和結(jié)締組織被完全切斷。順著平行于肌纖維方向切割牛肉時,從圖片中幾乎看不到單根肌纖維的斷裂。

2.7 相關(guān)性分析

2.7.1 垂直于肌纖維方向的剪切力與牛肉質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性分析 從表1可以看出，垂直肌纖維方向的剪切力與機械強度和咀嚼性呈極顯著正相關(guān)(r=0.867，p<0.01；r=0.816，p<0.01)，與硬度和膠黏性和HP呈顯著正相關(guān)(r=0.736，p<0.05；r=0.764，p<0.05；r=0.646，p<0.05)。

表1 垂直于肌纖維方向的剪切力與質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of shear force and texture properties perpendicular to the direction of muscle fibers

2.7.2 平行于肌纖維方向的剪切力與牛肉質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性分析 從表2可以看出，平行于肌纖維方向的剪切力與硬度、凝聚性、膠黏性、咀嚼性、回彈性呈極顯著正相關(guān)(r=0.673，p<0.01；r=0.820，p<0.01；r=0.658，p<0.01；r=0.652，p<0.01；r=0.791，p<0.01)，與機械強度呈現(xiàn)顯著負相關(guān)(r=0.557，p<0.05)。

表2 平行于肌纖維方向的剪切力與質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of shear force and texture characteristics parallel to the direction of muscle fibers

3 結(jié)論與討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn),平行于肌纖維方向的剪切力顯著(p<0.05)低于垂直于肌纖維方向,由掃描電鏡照片可以看到,垂直切割時是將肌纖維和結(jié)締組織完全切斷,這時肌纖維與肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜共同決定了剪切力;平行于肌纖維方向切割時,從切割面幾乎觀察不到單根肌纖維的撕裂,肌纖維束之間可能只是發(fā)生了平行擠壓,該過程或許會產(chǎn)生一定的阻力,并且由于在水平方向上結(jié)締組織機械強度是存在的,所以這時可能是結(jié)締組織起了關(guān)鍵作用,水平方向的剪切力可能由肌纖維的擠壓力和結(jié)締組織機械強度共同決定的,其力度遠遠小于將肌纖維和肌束膜完全切斷的力。由圖2和圖3可以看到,平行方向的剪切力隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長降低幅度比垂直方向的大,可能是由于加熱溫度時間的升高延長使得膠原蛋白發(fā)生凝膠化,使肌纖維間的潤滑度提升,使得剪切力減小,進一步說明平行方向的剪切力受結(jié)締組織影響較大。

由質(zhì)構(gòu)分析知道,不同肌纖維走向?qū)τ谂Ｈ赓|(zhì)構(gòu)特性(硬度、黏著性和咀嚼性)有一定的影響,但并不顯著。硬度是指使樣品變形所需要的力,黏著性是指食品表面與其他物體(舌、齒、腭等)粘在一起的力,咀嚼性指將固體食品咀嚼到可以吞咽時所做的功[18]。硬度和咀嚼性受肌纖維方向影響較大的原因經(jīng)分析與剪切力一致。

本研究測定了牛半腱肌在60、80、100 ℃下加熱不同時間下的結(jié)締組織機械強度,測定過程中發(fā)現(xiàn)肌纖維結(jié)構(gòu)弱化嚴重,結(jié)締組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性保持較好,排除了肌纖維的干擾,使得實驗結(jié)果在代表結(jié)締組織的強度上具有專一性。垂直于肌纖維方向的結(jié)締組織機械強度顯著高于平行方向,說明肌纖維走向?qū)Y(jié)締組織存在顯著影響。結(jié)締組織構(gòu)成肉的硬度主要是通過膠原蛋白組成的肌束膜、肌內(nèi)膜將肌原纖維連接形成有序的肌肉來實現(xiàn)的[17]。完整肌肉外圍包裹著一層肌外膜,肌外膜向內(nèi)延伸,把肌肉分成許多肌束,形成肌束膜,肌束膜進一步向內(nèi)延伸包裹單根肌纖維,形成肌內(nèi)膜。肌束的大小決定肉的質(zhì)地,不同部位肉間肌纖維和結(jié)締組織的含量差別很大,是造成硬度差異的重要原因。總的來說,結(jié)締組織在結(jié)構(gòu)上的延伸方向和肌纖維是一致的,但由于其復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),結(jié)締組織在垂直于肌纖維方向上也有一部分延伸。在測定剪切力的過程中,垂直肌纖維切割牛肉的力度有一部分是由結(jié)締組織提供的,這里的結(jié)締組織含量多、機械強度大。雖然結(jié)締組織在平行方向的剪切力度中占據(jù)了主導(dǎo),但由于平行方向下的結(jié)締組織含量低導(dǎo)致機械強度較小,所以平行于肌纖維方向的結(jié)締組織機械強度較小,而垂直方向的機械強度較大。

膠原蛋白分子由三條左旋的蛋白質(zhì)α-鏈組成,α-鏈進一步纏繞形成右旋的三重超螺旋結(jié)構(gòu)。對于可溶性膠原,加熱導(dǎo)致分子的三重螺旋解旋成單股,膠原分子的棒狀結(jié)構(gòu)就會變?yōu)榫€圈狀結(jié)構(gòu),而相鄰膠原分子間的共價交聯(lián)就會限制這種轉(zhuǎn)變[19],這些共價交聯(lián)是由賴氨酸或羥賴氨酸的殘基及它們的醛類物質(zhì)縮合形成的。膠原蛋白之間的成熟交聯(lián)為結(jié)締組織提供其所需的物理化學性質(zhì)和生物學穩(wěn)定性[20]。在生肉中吡啶啉的數(shù)量與剪切力的大小無關(guān),本研究中隨著加熱溫度的升高、加熱時間的延長,羥賴氨酸吡啶啉的含量呈遞增趨勢,而賴氨酸吡啶啉的含量呈下降趨勢,原因可能是由于雖然HP和LP結(jié)構(gòu)類似,但醛基酮途徑形成的HP的熱穩(wěn)定性要比醛亞胺途徑形成的LP的熱穩(wěn)定性要高。更值得注意的是,經(jīng)過相關(guān)性分析可知,HP與剪切力呈顯著正相關(guān),與結(jié)締組織機械強度呈極顯著正相關(guān),LP與結(jié)締組織機械強度呈極顯著負相關(guān)。說明膠原蛋白中羥賴氨酸吡啶啉的含量越高,結(jié)締組織機械強度越大,HP具有較強的熱穩(wěn)定性,隨著加熱溫度時間的增加,HP的相對含量增加,結(jié)締組織機械強度增加,剪切力增加。膠原蛋白共價交聯(lián)對牛肉嫩度有很大影響,羥賴氨酸吡啶啉的含量越高,結(jié)締組織強度越大。有學者研究得出膠原蛋白間的共價交聯(lián)與熟肉的嫩度并沒有很強的相關(guān)性[21],經(jīng)分析認為本研究中的高相關(guān)性可能與加熱時間的長短有關(guān)。HP、LP對垂直方向的結(jié)締組織機械強度影響比平行方向的大,原因可能是由于不同方向的結(jié)締組織含量有差異。

結(jié)締組織機械強度越大,肌外膜、肌束膜對肌纖維的包裹越緊密,肌纖維的排列越致密有序,肌纖維束之間的間隙越大,平行于肌纖維方向切割牛肉,擠壓過程中被肌束膜包裹的肌束平行移動起來較為容易利落,且肌束間隙變大會使切割面摩擦力減小,從而使剪切力減小,也可能是由于結(jié)締組織的凝膠化在肌纖維之間起到了一定的潤滑作用,從而使得剪切力較小。垂直肌纖維方向的剪切力與硬度、膠黏性和咀嚼性呈顯著正相關(guān),平行于肌纖維方向的剪切力與硬度、凝聚性、膠黏性、咀嚼性、回彈性呈極顯著正相關(guān),說明不同肌纖維方向的牛肉嫩度與質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān),其中膠黏性、硬度、咀嚼性對不同方向的剪切力有相同的貢獻,而平行方向的剪切力與凝聚性和回彈性有很大關(guān)聯(lián),凝聚性對咀嚼有較強和持續(xù)的抵抗,回彈性指產(chǎn)品努力恢復(fù)到最初狀態(tài)的能力,這一現(xiàn)象驗證了平行方向的切割過程主要涉及到肌纖維的擠壓和移位,其抵抗力來自于肌纖維和結(jié)締組織的變形,該力度與直接將肌纖維和結(jié)締組織切斷所需要的力相比確實比較小,進一步解釋了不同肌纖維方向下剪切力不同的原因。即垂直方向的嫩度特性由肌纖維和結(jié)締組織共同決定,平行方向的嫩度特性由少數(shù)結(jié)締組織和肌纖維變形擠壓力決定。