類胡蘿卜素清除自由基活性構效關系

劉科梅,鄔子彬,胡基志,陸 豫,余 勃,*

(1.南昌大學資源環境與化工學院,江西南昌 330031; 2.南昌大學化學學院,江西南昌 330031; 3.中德聯合研究院,江西南昌 330047)

類胡蘿卜素(carotenoids)普遍存在于綠色植物中,是多葉蔬菜中主要的抗氧化物之一。它作為一種天然抗氧化物,功能多樣,被廣泛運用于醫藥、食品、化妝等行業。類胡蘿卜素與人們的身體健康密切相關,具有保護視力、提高機體免疫力、抑制或緩解心血管疾病、維持畜禽正常生長與繁殖等功能[1-3]。現代醫學研究表明,自由基過量與人類大部分常見的疾病有關[4-5],類胡蘿卜素可與自由基發生反應,形成無害的產物,或通過破壞自由基鏈的反應,將自由基清除,從而有效地抑制或是緩解這些疾病的發生[6]。

類胡蘿卜素是具有多個共軛雙鍵的萜烯基團類化合物,主要分為烴類胡蘿卜素與含氧衍生物兩種[7-8]。由于其多帶一個或兩個端環,從環的結構與數目而言,又可分為直鏈分子與帶環分子兩種。直鏈分子如番茄紅素、六氫番茄紅素、八氫番茄紅素;而帶環分子根據環上基團結構及數目的不同,分為碳氫類胡蘿卜素(α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素)、羥基類胡蘿卜素(葉黃素、玉米黃素、β-隱黃質)、酮基類胡蘿卜素(角黃素、海膽酮)、α-羥基-酮基類胡蘿卜素(蝦青素)、羥基-環氧基類胡蘿卜素(紫黃素、花藥黃質)等[9-10]。基本結構以α-胡蘿卜素為例,見圖1。

圖1 α-胡蘿卜素Fig.1 α-carotene

目前,對于類胡蘿卜素的生物學功能、合成以及抗氧化等方面的研究較多;但運用量子化學計算類胡蘿卜素,從理論角度探討其抗氧化活性的研究仍較少。將理論結果與類胡蘿卜素抗氧化能力實際測定結果結合起來,是分析其自由基清除能力構效關系很好的研究方法。本文通過量子化學方法對13種類胡蘿卜素進行理論計算,同時使用四種自由基清除方法測定β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦青素的自由基清除能力,理論分析結合實際試驗,從中探討類胡蘿卜素的結構對其自由基清除能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-胡蘿卜素標品(97%) 美國Sigma公司;蝦青素(98%)、葉黃素(90%)、番茄紅素(98%)標品 北京瑞尼克生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(Agreement of basic telecommunications services,ABTS) 美國Sigma公司;水楊酸、過硫酸鉀、FeSO4·7H2O、Tris-HCl 緩沖液(pH=8.0)、鄰苯三酚 天津市大茂化學試劑廠;二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DOMSO)、乙醇、甲醇、鹽酸等 均為國產分析純。

TU-1810PC紫外可見光分光光度計 北京普析公司;T型恒溫水浴鍋 德國LAUDA公司;ER-180A型電子分析天平 日本AND公司;Multiskan spectrum全波長酶標儀 Thermo Scientific公司;Gaussian 09軟件 南昌大學高等研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 ABTS自由基清除能力的測定 參考Tang等[11]的實驗方法。將0.0038 mg/mL ABTS、0.00067 mg/mL過硫酸鉀按1∶1體積比混合,室溫避光12～16 h后稀釋40倍待用。取ABTS 4 mL,分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL用DMSO溶解的β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素及蝦青素200 μL,混勻后用紫外分光光度計在734 nm下測定吸光度。對照組以相同體積的甲醇代替ABTS,空白組以相同體積的DMSO代替樣品。

式中:A0為空白組的吸光度;Ai為樣品組的吸光度;Aj為對照組的吸光度。

1.2.2 DPPH自由基清除能力的測定 參考尹薔[12]、Kim等[13]的實驗方法。配制0.0394 mg/mL的DPPH溶液待用。取0.30、0.45、0.60、0.75、0.90 mg/mL用DMSO溶解的β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素及蝦青素20 μL與3 mL DPPH液混合均勻,使用酶標儀在519 nm下測定吸光值。對照組以相同體積的乙醇代替DPPH,空白組以相同體積的DMSO代替樣品。

式中:A0為空白組的吸光度;Ai為樣品組的吸光度;Aj為對照組的吸光度。

1.2.3 羥自由基清除能力的測定 參考Wang[14]等的實驗方法。在96孔板上加入1.24 mg/mL的水楊酸溶液10 μL、2.5 mg/mL的硫酸亞鐵溶液10 μL、超純水200 μL,再分別加入15 μL濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL用DMSO溶解的β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素及蝦青素,最后加入10μL 0.03%的H2O2啟動反應。使用酶標儀37 ℃孵育15 min后,在510 nm下測定吸光值。對照組用同等體積的超純水代替H2O2,空白組用同等體積的DMSO代替樣品。

式中:A0為空白組的吸光度;Ai為樣品組的吸光度;Aj為對照組的吸光度。

1.2.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定 參考Zhang[15]等的實驗方法。將0.05 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)、樣品液、1.26 mg/mL的鄰苯三酚液置于25 ℃水浴中預熱20 min。取Tris-HCl 3 mL、鄰苯三酚液200 μL混合,并分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL用DMSO溶解的β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素及蝦青素200 μL,混勻后于25 ℃水浴中準確反應5 min。最后加入300 μL 10 mol/L鹽酸終止反應,在320 nm處測定吸光值。對照組以同等體積的HCl代替鄰苯三酚,空白組以同等體積的DMSO代替樣品。

超氧陰離子自由基清除率S(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100

式中:A0為空白組的吸光度;Ai為樣品組的吸光度;Aj為對照組的吸光度。

1.2.5 相關量化理論參數的計算方法 通過Gaussian view軟件構建β-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素、番茄紅素、六氫番茄紅素、八氫番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃素、海膽酮、角黃素、花藥黃質、紫黃素十三種類胡蘿卜素的分子模型,運用Gaussian 09程序中的半經驗法AM1對分子模型進行初步優化,再利用密度泛函法B3LYP/6-311G(d,p)基組對初步優化的構型進行全幾何構型優化并進行頻率分析,直至無虛頻產生得到優勢構型[16-17]。得到需要的優勢構象后,最后通過密度泛函法計算其能量,得到前線軌道能級差、原子凈電荷分布等相關量化理論參數。以上計算均采用Gaussian09程序軟件完成,計算平臺由南昌大學高等研究院高性能計算集群(浪潮天梭TS10000)提供。

1.3 數據統計分析

每個結果重復處理3次,并采用Excel軟件制圖。實驗數據采用SPSS 19.0軟件處理,其中p<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 4種類胡蘿卜素自由基清除能力的測定結果

選取了β-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、番茄紅素進行自由基清除能力測定,這4種類胡蘿卜素均是常見的類胡蘿卜素[18]。

2.1.1 4種類胡蘿卜素的DPPH自由基清除能力 根據圖2可知,4種類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率差異顯著,且蝦青素的DPPH自由基清除率遠遠高于其他幾種類胡蘿卜素(p<0.05)。β-胡蘿卜素在0.45、0.75、0.9 mg/mL的自由基清除率無顯著性差異(p>0.05),葉黃素與番茄紅素在0.45、0.6、0.75、0.9 mg/mL的自由基清除率無顯著性差異(p>0.05),而蝦青素在0.45、0.6 mg/mL的DPPH自由基清除率與其他三組濃度具有顯著性差異(p<0.05)。4種類胡蘿卜素的DPPH自由基清除能力順序為:蝦青素>番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素。

圖2 4種類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of 4 carotenoids注:小寫字母不同表示相同濃度不同種類胡蘿卜素間差異 顯著(p<0.05);大寫字母不同表示相同種類胡蘿卜素 不同濃度間差異顯著(p<0.05);圖3～圖5同。

2.1.2 4種類胡蘿卜素的ABTS自由基清除能力 由圖3可知,蝦青素的ABTS自由基清除率最高,而β-胡蘿卜素在濃度達到0.4 mg/mL后,ABTS自由基清除率顯著小于其他3種類胡蘿卜素(p<0.05)。與濃度為0.2 mg/mL時相比,葉黃素與番茄紅素的ABTS自由基清除率隨濃度變化較大;濃度為0.2 mg/mL時,葉黃素的ABTS自由基清除率顯著大于番茄紅素(p<0.05);隨著濃度逐漸增大,兩者清除率差距逐漸減小,1 mg/mL濃度下,番茄紅素與葉黃素的ABTS自由基清除率無顯著性差異(p>0.05)。四種類胡蘿卜素ABTS自由基清除能力順序為:蝦青素>番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素。

圖3 4種類胡蘿卜素的ABTS自由基清除率Fig.3 ABTS free radical scavenging rate of 4 carotenoids

2.1.3 4種類胡蘿卜素的超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知,濃度對蝦青素的超氧陰離子自由基清除率影響非常大,在0.2 mg/mL濃度下,番茄紅素的超氧陰離子自由基清除率顯著高于其他3種類胡蘿卜素(p<0.05);濃度為到1 mg/mL時,蝦青素與番茄紅素的超氧陰離子自由基清除率無明顯差異(p>0.05)。β-胡蘿卜素在0.4、0.6、0.8 mg/mL濃度下自由基清除率無顯著性差異(p>0.05)。葉黃素在0.6、0.8 mg/mL濃度下的自由基清除率顯著高于0.2、0.4 mg/mL,在1.0 mg/mL濃度下顯著高于0.6、0.8 mg/mL。而四種類胡蘿卜素超氧陰離子自由基清除能力順序為:蝦青素≥番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素。

圖4 4種類胡蘿卜素的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Superoxide anion free radical scavenging rate of 4 carotenoids

2.1.4 4種類胡蘿卜素的羥自由基清除能力 由圖5知,0.2 mg/mL濃度下,蝦青素與葉黃素的羥自由基清除率較高,但兩者差異不顯著(p>0.05);0.4 mg/mL濃度下,蝦青素的自由基清除率最高;0.6～1.0 mg/mL濃度下,蝦青素與番茄紅素的羥自由基清除率遠遠高于葉黃素與β-胡蘿卜素(p<0.05)。4種類胡蘿卜素羥自由基清除能力順序為:蝦青素≥番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素。

圖5 4種類胡蘿卜素的羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rates of 4 carotenoids

4種類胡蘿卜素中,番茄紅素屬于直鏈式類胡蘿卜素;β-胡蘿卜素屬于碳氫類胡蘿卜素;葉黃素屬于羥基類胡蘿卜素,含2個羥基;蝦青素屬于α-羥基-酮類胡蘿卜素,含2個羥基及2個酮基。其共軛雙鍵數目為:蝦青素13個>番茄紅素11個>葉黃素10個=β-胡蘿卜素10個。

根據圖2～圖5可知,對于不同種類的自由基,類胡蘿卜素的清除能力具有較大差異。結合四種自由基清除能力測定方法,可得出結論,總體上蝦青素的自由基清除能力最強,其次是番茄紅素、葉黃素,β-胡蘿卜素最弱,這與它們的共軛雙鍵數目排序一致,表明共軛雙鍵數目越多,類胡蘿卜素的自由基清除活性越高;對比β-胡蘿卜素與葉黃素,發現端環上的羥基提高了類胡蘿卜素的自由基清除活性。可見,共軛雙鍵數目及其端環上的基團都是影響類胡蘿卜素自由基清除能力的重要參數。

本試驗得到的結果與袁磊[19]研究結果存在一些差異,其根據DPPH法、水楊酸法和鄰苯三分法測定蝦青素、番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素的自由基清除能力,得到結論蝦青素>葉黃素>β-類胡蘿卜素>番茄紅素。分析原因可能是:用于測定的類胡蘿卜素樣品不同,樣品純度不一致,導致結果存在差異;自由基清除能力測定方法不一致。劉曉庚[20]、林戀竹等[21]發現樣品濃度、反應時間對分子的自由基清除能力影響較大,在不同的濃度、反應時間下,可能得到不一樣的比較結果。

2.2 前線分子軌道

前線軌道是指分子參與反應分子軌道房發生變化時,優先起作用的分子軌道,即分子中的最高被電子占有分子軌道(Highest occupied molecular orbital,HOMO)和最低空分子軌道(Lowest unoccupied molecular orbital,LUMO)。前線軌道能級差ΔE(LUMO-HOMO)表征了分子從基態到激發態所需要的能量,能極差越小,電子越容易發生躍遷,分子的反應活性越強[22]。

由表1可知,13種類胡蘿卜素的前線軌道能級差ΔE大小順序:番茄紅素?蝦青素<角黃素≈海膽酮<β-隱黃質≈玉米黃素<β-胡蘿卜素<花藥黃質≈葉黃素<α-胡蘿卜素<紫黃素<六氫番茄紅素<八氫番茄紅素。番茄紅素的ΔE要遠遠小于其他類胡蘿卜素,其次是α-羥基-酮基類胡蘿卜素、酮基類胡蘿卜素、羥基類胡蘿卜素、羥基-環氧基類胡蘿卜素與碳氫類胡蘿卜素。共軛雙鍵的數目對分子的ΔE影響顯著;而帶環的類胡蘿卜素,明顯受到共軛雙鍵數目與基團結構、數目的影響。根據十三種類胡蘿卜素分子的能級差推測,在提高類胡蘿卜素活性上,酮基的作用最大,其次是羥基與環氧基,實驗測得,整體自由基清除能力為蝦青素>葉黃素>β-胡蘿卜素,驗證了這一點。

表1 13種類胡蘿卜素的部分性質和前線分子軌道能級差Table 1 The partial properties and ΔE of 13 carotenoids

蝦青素與紫黃素的前線分子軌道能級圖見圖6。由圖6可以看出,平面型離域大π鍵主要集中在共軛長鏈上,代表它是類胡蘿卜素主要的活性部位。此外,電子云在端環碳碳雙鍵、酮基、環氧基上也有分布。根據其電子云密度大小,其活性強弱碳碳雙鍵>酮基>環氧基。

類胡蘿卜素清除自由基有兩種機制:氫原子轉移機制(Hydrogen atom transfer,HAT)和單電子轉移機制(Single electron transfer,SET)。氫原子轉移機制[23]:CAR+R·→CAR·+RH,該機制中類胡蘿卜素(CAR)提供氫,使自由基(R·)與氫結合生成一個更穩定的自由基,從而中斷自由基鏈式反應。單電子轉移機制[24]:CAR+R·→CAR·++R-/CAR+R·→CAR·-+R+,該機制中類胡蘿卜素(CAR)能通過轉移或接受電子而清除自由基(R·)。對于不同的自由基清除能力測定方法,由于所測自由基的親電給電性質不一樣,不同方法所得的結果也有一定差異;對于不同的類胡蘿卜素,其清除自由基的機制可能是其中一種,也有可能是兩種并存。量子化學理論認為,前線分子軌道能與分子的活性密切相關,最高占據軌道能與最低空分子軌道能分別代表著分子的給電子能力與接受電子的能力。根據圖6可知,蝦青素的酮基位點上,最低空分子軌道上的電子云密度比最高占據軌道上的大,代表其親電能力較強;而紫黃素的環氧基上,最高占據軌道的電子云密度比最高占據軌道大,代表其給電子能力較強。由此推測,酮基為親電子基團,環氧基為給電子基團。

圖6 蝦青素與紫黃素的前線分子軌道能級圖Fig.6 The frontier molecular orbital of astaxanthin and violaxanthin

2.3 NPA電荷分析

在由電荷控制的反應中,原子的負電荷越多,其受親電試劑進攻的可能性越大;反之,原子的正電荷越多,則受親核試劑進攻的可能性也越大。自由基一般都是負電子,所以化合物中C原子所帶正電荷越大,就是與自由基反應的最大可能活性部位。類胡蘿卜素分子中的羥基、酮基、環氧基相鄰的C原子均帶著正電荷,電荷差值大,說明這些基團位點都是類胡蘿卜素的活性部位。

根據分子結構理論,原子間電荷差值越大,電子越容易發生躍遷,原子間鍵越容易發生解離,容易發生化學反應;反之,則不易發生化學反應。量子化學中一般認為電荷差值較大的位點為分子活性位點[25]。根據表2可知,酮基與相鄰碳原子的電荷差值均超過了1.2,羥基、環氧基上的電荷差值則在0.8、0.9左右,初步推測類胡蘿卜素環上的酮基活性要大于羥基及環氧基。對比同分異構體葉黃素與玉米黃素的凈電荷差值,3-OH上幾乎一致,但3′-OH上玉米黃素>葉黃素,可能是玉米黃素比葉黃素多一個共軛雙鍵導致。將海膽酮與β-隱黃質、玉米黃素與角黃素進行對照分析,發現帶酮基的類胡蘿卜素共軛雙鍵都比較多,酮基的雙鍵增大了分子的共軛體系,推測這是酮基位活性要大于羥基位、環氧基位的原因。蝦青素較角黃素多了兩個羥基,酮基位點上的電荷差值略大于角黃素,較玉米黃素多了兩個酮基,羥基位點上的電荷差值卻明顯小于玉米黃素,由此推測,環上羥基,可促進酮基位的活性。由于不含環氧基的類胡蘿卜素環上5、6、5′、6′位上多是雙鍵,對分子活性影響大,不易對環氧基的活性與其他基團進行直觀的對比分析。

表2 8種類胡蘿卜素基團位點上的凈電荷差值Table 2 The net charge difference on the 8 carotenoids

3 結論

本研究通過量子化學手段對13種類胡蘿卜素進行了計算,同時使用DPPH自由基清除方法、ABTS自由基清除方法、超氧陰離子自由基清除方法、羥自由基清除方法β-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素以及番茄紅素的自由基清除能力進行了測定。結果表明,四種類胡蘿卜素的DPPH自由基清除能力順序為:蝦青素>番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素;ABTS自由基清除能力順序為:蝦青素>番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素;超氧陰離子自由基清除能力順序為:蝦青素≥番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素;羥自由基清除能力順序為:蝦青素≥番茄紅素≥葉黃素>β-胡蘿卜素;總體上蝦青素的自由基清除能力最強,其次是番茄紅素、葉黃素,β-胡蘿卜素最弱。四種類胡蘿卜素的多個共軛雙鍵的特殊結構是它具有自由基清除能力的重要原因,而端環上的基團對類胡蘿卜素活性也有影響,碳碳雙鍵、羥基、酮基以及環氧基能夠促進分子的活性。其中,碳碳雙鍵、酮基影響了分子的共軛體系,對類胡蘿卜素活性影響最大。對于帶環的類胡蘿卜素,根據前線軌道能級差及NPA凈電荷分布,對其活性影響最大的基團為酮基,其次是羥基與環氧基,這與試驗測定的自由基清除能力強弱順序相吻合,表明前線軌道能級差、NPA凈電荷分布是表征帶環類胡蘿卜素自由基清除的能力的重要參數。本研究分析了類胡蘿卜素清除自由基活性的構效關系,但由于類胡蘿卜素種類繁多、分子量大,難以進行高精度、規模性、系統性的量子化學計算,類胡蘿卜素清除自由基的機理還需深入探討。