咖啡濃度對咖啡牛奶體系穩(wěn)定性 及消化行為的影響

張志鵬,蔣 將,劉元法

(江南大學食品學院,食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

咖啡牛奶是一種新型功能性飲品,飄香醇厚的咖啡加上芳美濃郁的牛奶,從而形成了具有雙重口感享受的飲品。它不僅風味獨特,而且還具有咖啡的生物學功能,現(xiàn)今流行病學家研究發(fā)現(xiàn),長期飲用咖啡可以降低2型糖尿病[1]、結(jié)腸癌[2]和心血管疾病[3]的發(fā)病率和死亡率,這都歸功于咖啡中富含的酚酸,特別是氫化肉桂酸(咖啡酰奎寧酸、阿魏酸奎寧酸、咖啡酸)[4],因為酚酸可以改善能量代謝、減少體內(nèi)脂肪、提高肝臟脂肪分解代謝能力[5],從而增加人體健康;而體系中的牛奶是成人和嬰兒攝取蛋白質(zhì)的主要來源,也為人體提供了生長發(fā)育所需要的能量和氨基酸,因此咖啡牛奶作為一種新型飲品深受大家喜愛,現(xiàn)已在日本軟飲料市場占有很大的比例[6]。

但是研究發(fā)現(xiàn)當體系中咖啡提取物的含量過高時,咖啡牛奶將變得不穩(wěn)定,有些甚至出現(xiàn)脂肪分離、氧化等現(xiàn)象[7]。現(xiàn)在主要通過添加合適的乳化劑來達到穩(wěn)定體系的效果,國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)硬脂酰乳酸鈉、單甘酯和蔗糖酯以3∶4∶2的比例復配形成的復合乳化劑的穩(wěn)定效果最好[7];國外研究發(fā)現(xiàn)高親水親油平衡值(HLB)的蔗糖酯和甘油二酯將加速體系的分離,而聚甘油酯則抑制體系的分離[6]。除此之外,現(xiàn)在大量的研究已經(jīng)證實咖啡中的酚酸將導致牛奶中蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而達到促進或抑制蛋白消化能力的作用[8],但是很少有研究對咖啡牛奶的體外胃、腸模擬消化行為進行表征。

因此,本文采用新型乳液穩(wěn)定性評價手段Turbiscan Lab多重光散射儀以及馬爾文納米粒度/電位儀，來研究不同咖啡濃度對咖啡牛奶體系穩(wěn)定性的影響;之后對不同樣品進行體外模擬胃、腸消化,以不同消化階段體系的微觀結(jié)構(gòu)和蛋白電泳作為評價手段，來表征咖啡濃度對咖啡牛奶消化行為的影響。以期為咖啡牛奶的研究開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

星巴克研磨咖啡粉、紙質(zhì)濾膜 無錫星巴克咖啡店;全脂奶粉 新西蘭恒天然有限公司;胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、四甲基乙二胺(TEMED)、AB-3(49.5%聚丙烯酰胺和3%雙丙烯酰胺混合儲備液) 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司;豬膽鹽、過硫酸銨、甘油 國藥化學試劑公司;其他試劑 均為分析純。除另有說明外,所有濃度均以重量百分比為基礎(chǔ)(即 w/w,%)表示。

Turbiscan Lab多重光散射儀 法國Formulaction公司;電泳儀、凝膠成像儀 美國Biorad公司;JJ-1B 強力恒速電動攪拌器 金壇市金南儀器廠;納米粒度及Zeta電位儀(Zetasizer nano ZS) 英國馬爾文公司;激光共聚焦顯微鏡(LSM710) 德國蔡司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同咖啡含量的乳化液體系制備 10 g速溶咖啡粉和25 g全脂奶粉分別溶解于100、50 ℃的100 mL去離子水中,并將咖啡液通過紙質(zhì)濾膜進行過濾;溶解完全后,分別取50、25、12.5 mL的咖啡濾液與50 mL的全脂牛奶在室溫下混合,并添加相應量的去離子水,得到50%高濃度咖啡(H)、25%中濃度咖啡(M)、12.5%低濃度咖啡(L)以及不添加咖啡濾液的全脂牛奶空白(C)四種不同體系,室溫下混合30 min后,通過高壓均質(zhì)機以30 MPa的均質(zhì)壓力,均質(zhì)兩次后放入4 ℃冰箱中，進行下一步體系穩(wěn)定性和體外模擬胃、腸消化行為研究。

1.2.2 背散射光強度和穩(wěn)定性指數(shù) 采用Turbiscan Lab多重光散射儀對樣品進行乳液穩(wěn)定性指數(shù)測定。移取20 mL樣品于特制的石英樣品瓶中(取樣過程中盡量不要將樣品撒到試劑瓶壁上),放入Turbiscan Lab多重光散射儀中,使用近紅外光(λ=880 nm)從樣品瓶底部開始掃描,經(jīng)中部到頂部掃描一次。設(shè)置掃描間隔30 s,掃描時長1 h。,將實驗溫度設(shè)為50 ℃,進行加速實驗。得到不同時間乳化液背散射光強度曲線圖,以及不同時間乳化液的穩(wěn)定性指數(shù),該值越小,體系就越穩(wěn)定[9]。

1.2.3 粒徑測定 用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH7.0)將樣品稀釋500倍,通過馬爾文納米粒度儀對樣品進行5次重復測量,測量開始前的平衡時間設(shè)定為1 min,溫度為25 ℃,掃描角度為120 °,掃描時間為120 s,波長為632.8 nm,以水為溶劑,折射率為1.333。

1.2.4 Zeta 電位分析 樣品用磷酸緩沖液(0.01 mol/L,pH7.0)稀釋500倍,用馬爾文納米電位儀對乳化液中粒子的表面電位進行測定,設(shè)定溫度25 ℃。

1.2.5 體外模擬腸胃消化 根據(jù)Tang等[10]的方法對不同樣品進行體外模擬胃、腸消化,并做了一些改進。將10 mL樣品與10 mL胃液(2 g NaCl和7 mL濃HCl混合,用去離子水稀釋至1 L;胃蛋白酶(E/S:1∶20))在37 ℃水浴中進行混合,用0.1～1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,之后在37 ℃的水浴條件反應1 h。反應結(jié)束后立刻用0.9 mol/L的NaHCO3將體系pH調(diào)至5.3,用1 mol/L的NaOH 繼續(xù)調(diào)節(jié)pH至7.5,加入胰蛋白酶(E/S:1∶20),混勻后37 ℃下反應1 h。將不同消化階段的消化液于沸水中滅酶10 min終止反應,4 ℃環(huán)境下冷藏，進行下一步電泳和共聚焦顯微鏡分析。

1.2.6 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE) 根據(jù)Sch?gger等[11]的方法,用4%濃度的濃縮膠(0.712 mL AB-3,1.5 mL 電泳緩沖液(Tris buffer),4.5 μL四甲基乙二胺(TEMED),45.1 μL 10%過硫酸銨,3.88 mL水)和16%濃度的分離膠(1.2 mL甘油,4.9 mL AB-3,4 mL Tris buffer,4 μL TEMED,40 μL 10%過硫酸銨,2.3 mL水)。將樣品溶解在樣品緩沖液(25 mL 0.5 mol/L Tris buffer,20 mL甘油,40 mL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS),15 mL水,pH6.8)中,調(diào)整蛋白質(zhì)最終濃度為2 mg/mL,上樣量為15 μL。在恒定電壓下進行凝膠電泳,初始電壓為30 V,直到樣品經(jīng)過濃縮膠,進入分離膠后,調(diào)節(jié)電壓為120 V。蛋白凝膠經(jīng)染色和脫色后,在凝膠成像儀中進行電泳圖像采集。

1.2.7 共聚焦顯微鏡 吸取1 mL不同消化時間的消化液與20 μL的尼羅紅(w/v,0.1%)混勻,避光條件下放置30 min染色,用取樣針將樣品點于載玻片上,用硅油密封蓋玻片的邊緣,放置顯微鏡下進行觀察。參數(shù)設(shè)置:顯微鏡放大倍數(shù):×50;尼羅紅的激發(fā)波長是514 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次實驗所得數(shù)據(jù)均為3次重復3次平行實驗,結(jié)果均以平均值±標準偏差表示,圖表由Origin 8.0和Sigmaplot 12.5軟件制作,顯著性分析使用SPSS 18.0軟件Duncan法(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液穩(wěn)定性

如圖1所示,與空白組相比,樣品瓶底部的背散射光強度降低,其中高含量咖啡體系最明顯(下降了5%);而樣品瓶頂部的背散射光呈現(xiàn)略微下降的趨勢,這表明咖啡含量的升高會導致體系底部乳化液油滴濃度的降低以及頂部輕微降低的現(xiàn)象;中部背散射光強度升高,并且出現(xiàn)了明顯的波動,這說明隨著咖啡含量的升高,體系的穩(wěn)定性變差。這可能由于咖啡導致全脂奶溶液底部和頂部的油滴向中部聚集,從而導致體系的穩(wěn)定性降低[12]。

圖1 不同咖啡含量體系樣品1 h內(nèi)的背射光強度圖譜Fig.1 Back light intensity spectra of samples with different coffee contents within 1 h

另外,可以用簡單的穩(wěn)定性動力學指數(shù)(Stability Index,TSI)表征整個體系的穩(wěn)定性。圖2表明,經(jīng)過1 h的加速實驗,空白組的穩(wěn)定性指數(shù)呈直線上升趨勢,最終達到了1.2;但是添加咖啡的樣品,無論是低濃度體系還是高濃度體系,經(jīng)過1 h的加速實驗,TSI均顯著提高,分別達到了1.4、1.8、2.1。文獻[13]報道背散射光強變化越大,穩(wěn)定性指數(shù)升高,測量體系就越不穩(wěn)定。

圖2 不同咖啡含量體系樣品1 h內(nèi)的穩(wěn)定性指數(shù)變化曲線Fig.2 TSI curves of samples with different coffee contents within 1 h

2.2 粒徑測定

體系粒徑減少會導致乳液中分散粒子的相互作用增大,從而提高乳液的穩(wěn)定性。圖3為不同含量咖啡乳液體系最小平均粒徑的粒徑分布圖。圖4為其相應的平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)。從粒徑分布圖得知,隨著咖啡濃度的升高,乳液體系的粒徑分布整體向右移,在5000 nm處出現(xiàn)一個小峰,并且咖啡濃度越高,該峰就越大。隨著咖啡濃度的增加,平均粒徑從306 nm增加到了643.6 nm(高濃度咖啡體系),結(jié)合圖2的實驗結(jié)果,粒徑增大可能是由于咖啡的加入導致體系的不穩(wěn)定,發(fā)生了一定程度的聚集;除此之外,空白組為單峰分布狀態(tài),并且粒徑分布很窄,咖啡加入到全脂奶中,體系變?yōu)殡p峰分布狀態(tài),且粒徑的分布變寬,PDI值增大(從0.34增加到0.48)。這可能由于咖啡是混合物,里面含有很多大分子物質(zhì),咖啡含量越高,體系的組成越復雜,混亂度增加,從而導致液滴尺寸向非均勻性發(fā)展,多分散指數(shù)增大。

圖3 不同咖啡含量體系樣品的粒徑分布圖Fig.3 The particle size distribution of different coffee content system samples

圖4 不同咖啡含量的體系樣品的平均粒徑(A)和PDI(B)Fig.4 The average particle size(A)and polydispersity index(B)of different coffee content system samples

2.3 電位分析

與空白樣品的Zeta電位相比,添加咖啡會導致體系電位絕對值降低,并且隨咖啡濃度升高下降越明顯。乳液的穩(wěn)定是由液滴間的靜電排斥維持的,因此體系電位值下降也是導致體系穩(wěn)定性降低的一個原因。除此之外,Zeta-電位在某種程度上反映了油-水界面上蛋白質(zhì)分子間的斥力[14],這表明咖啡的添加導致乳液中蛋白質(zhì)分子間的排斥力下降。一些研究表明，咖啡中的酚類化合物與蛋白質(zhì)共價結(jié)合會導致蛋白質(zhì)分子中的凈電荷發(fā)生改變,進而影響蛋白的表面性質(zhì)[15]。

圖5 不同咖啡含量的體系樣品的Zeta電位Fig.5 Zeta Potential of different coffee content system samples

2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)

全脂牛奶中主要的蛋白是酪蛋白(CN)和乳清蛋白(WPI),如圖6所示,在消化過程中,無論咖啡濃度的高低,所有蛋白質(zhì)亞基都降解為了小分子物質(zhì)。α-CN和β-CN,在胃水解1 h后,電泳圖中只剩下少量小肽,再經(jīng)過1 h腸水解,電泳圖上幾乎已經(jīng)看不到肽,Sarkar A等[16]發(fā)現(xiàn)在胃消化15 min時,β-CN和κ-CN已被完全消化,1 h后只能檢測到少量α-CN。β-Lg和α-La,發(fā)現(xiàn)胃消化1 h后,α-La已被完全水解,而β-Lg還有些許殘留,Pena-Ramos[17]等人也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。不同咖啡濃度體系間蛋白肽條帶趨勢變化基本相同,說明咖啡的添加對體系中蛋白消化沒有負面影響。

圖6 不同咖啡含量體系樣品的模擬腸胃消化的電泳圖Fig.6 The electrophoresis patterns simulating digestion of different coffee content systems

2.5 共聚焦顯微鏡

如圖7所示,在體外模擬胃、腸消化過程中,不同樣品消化液的微觀結(jié)構(gòu)存在差異。在模擬胃消化階段,胃液中較低的pH和較高的離子強度將削弱整個體系的靜電作用力,通過降低液滴間的靜電斥力導致體系的聚集現(xiàn)象;除此之外,胃液中胃蛋白酶的存在使液滴表面的蛋白分子水解,從而促進液滴的聚集[18]。但是高含量咖啡體系出現(xiàn)了較大的聚集體,這說明高含量的咖啡會促進更多油滴的暴露、聚集;而體外模擬腸消化過程中,油滴聚集體消失,可能是由于腸消化過程中添加的膽鹽,它是一種較好的乳化劑,從而形成新的乳液滴。

圖7 不同咖啡含量體系樣品的 模擬腸胃消化的微觀圖(×50)Fig.7 Confocal microscopy images simulating digestion of different coffee content systems(×50)

3 結(jié)論

隨著咖啡濃度的升高,咖啡牛奶體系穩(wěn)定性下降,特別是50%高濃度咖啡體系,1 h內(nèi)的TSI升高了0.9;平均粒徑增加了337.6 nm;電位值降低了6。體外模擬胃、腸消化,不同階段的SDS-PAGE以及共聚焦顯微圖表明咖啡含量對體系中蛋白的消化沒有負面影響;但是與空白相比,咖啡含量較高的體系(25%、50%)在體外模擬胃的消化過程中,會促進油滴的暴露,從而產(chǎn)生較大的油脂聚集體。這些結(jié)果表明,隨著咖啡濃度升高,體系穩(wěn)定性下降,且在體外模擬胃消化過程中促進油滴的暴露與聚集,但對體系中蛋白的消化無負面影響。