白靈菇蛋白質的 理化及功能特性

薛 媛,楊 沫,魏君慧,陳怡萌，徐懷德

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西咸陽 712100)

白靈菇(Pleurotusnebrodensis)在我國廣泛種植,年產量超過18萬噸,人工栽培產地遍及南北諸省,其中以豫、津、冀省區生產規模較大[1]。白靈菇子實體肥大潔白,脆嫩可口,香味濃郁,營養豐富[2]。其中,蛋白質含量占干菇的27.14%,氨基酸含量約167.2 g/kg,其中必需氨基酸占氨基酸總量的40.07%[3]。在白靈菇生產過程中產生大量殘次白靈菇,其廉價易得且富含蛋白質,但常常被作堆肥或堆肥[4],造成資源浪費。對白靈菇進行深加工,不僅可以提高白靈菇產品的附加值,拓展消費市場,還可以降低菇農栽培風險[5]。目前,白靈菇蛋白質的研究主要集中于蛋白質營養價值[6]、氨基酸風味[7]和蛋白質的生物活性[8-9],而對白靈菇蛋白質理化性及功能特性的研究相對少見。

鹽析是蛋白質制備的常用方法,可在純化蛋白初期迅速濃縮蛋白質,具有分離效果佳、蛋白質不易發生不可逆變性、經濟可行等優勢[10]。呂薔等[11]用分段鹽析法從雙孢蘑菇中分離純化過氧化物酶;黃志立等[12]用分段鹽析法從云芝菌絲體中分離純化超氧化物歧化酶。

為此,本論文以殘次級白靈菇為原料,通過分段鹽析法制備白靈菇分段鹽析蛋白質組分,并研究分段鹽析蛋白質組分的理化性及功能特性,以期為白靈菇蛋白質的綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白靈菇 楊凌康農菌業有限公司;Ellman試劑(DTNB) 美國 Sigma公司;溴化鉀 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;β-巰基乙醇 美國Amresco公司;甲醇、乙腈 色譜純,美國 TEDLA公司;四氫呋喃、三乙胺、結晶乙酸鈉、三氯乙酸、Tris、甘氨酸等 均為分析純。

DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;K9840型凱氏定氮儀 海能儀器股份有限公司;FD5-2.5E型冷凍干燥機 武漢天儀海波儀器有限公司;LS55型熒光分光光度計 美國PE公司;Vetex 70型傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理 新鮮殘次級白靈菇切條,經40 ℃熱風干燥至恒重,粉碎過40目篩,4 ℃密封保存備用。

1.2.2 菇粉基本成分測定 蛋白質的測定:GB/T 15673-2009;粗多糖的測定:苯酚硫酸法[13];粗纖維的測定:GB/T 6434-2006中的過濾法;粗脂肪的測定:GB/T 15674-2009;灰分的測定:GB/T 5009.4-2010。

1.2.3 白靈菇蛋白質的提取分離 稱取菇粉50 g,用濃度為5 mol/L的NaOH溶液調節浸提水液至堿性(pH10.0),在料液比1∶15、溫度40 ℃條件下浸提2 h,6000 r/min離心20 min,收集上清液,對沉淀物在相同條件下重復浸提,6000 r/min離心20 min,合并兩次浸提所得浸提液。向堿性浸提液中逐步加(NH4)2SO4制備分段鹽析蛋白質(簡寫為FPs),具體步驟如下:向堿性浸提液中逐步加入(NH4)2SO4,根據《調整硫酸銨溶液飽和度計算表》,調整鹽飽和度依次達60%、80%、90%,4 ℃下靜置過夜,6000 r/min離心20 min,依次收集沉淀,分別得60%、80%、90%鹽飽和度分段鹽析蛋白質(分別簡寫為F60、F80、F90)。蒸餾水復溶蛋白質,于4 ℃用蒸餾水透析除鹽(透析分子量為8000～14000 Da),冷凍干燥。

1.2.4 蛋白質的析出率、含量及多糖含量的測定 采用考馬斯亮藍法[14]測定蛋白質提取率與析出率。

式(1)

式中,c為上清液蛋白質濃度(mg/mL);V為上清液體積(mL);m為菇粉質量(mg);γ為樣品中粗蛋白含量(%)(蛋白含量的計算參考國標GB/T 15673-2009)。

式(2)

式中,c1為復溶蛋白質液濃度(mg/mL);V1為復溶蛋白液體積(mL);c為上清液蛋白質濃度(mg/mL);V為上清液體積(mL)。

采用苯酚硫酸法[15]測定粗蛋白質中的多糖含量。

1.2.5 白靈菇蛋白質的分子量測定 制備濃度為15%的分離膠和4%的濃縮膠,進行電泳。低分子質量Marker(14.4～97.4 kDa)。試驗初始電壓為90 V,待樣品進入分離膠后調整為110 V。電泳結束后,采用考馬斯亮藍G250染色30 min,洗脫液脫色至背景清晰。

1.2.6 蛋白質二級結構的分析與測定 采用傅里葉變換紅外光譜儀，參照Arogundade等[15]的方法分析蛋白質組分的二級結構。

1.2.7 表面疏水性測定 用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH7.0)分別稀釋FPs的蛋白質溶液(4 mg/mL),得濃度范圍為0.0625～4 mg/mL的蛋白質稀釋溶液。參照Yu等[16]的方法測定表面疏水性。

1.2.8 白靈菇蛋白質的二硫鍵測定 參照Ma等[17]的方法測定FPs的二硫鍵。

1.2.9 白靈菇蛋白質內源熒光光譜 采用熒光分光光度計，參考Arogundade等[15]的方法對FPs進行內源熒光光譜分析。

1.2.10 F60的溶解性測定 稱取0.1 g F60,分別加入20 mL pH分別為2.2、3.0、3.8、4.0、4.2、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.2 mol/L),配制蛋白質溶液(5 mg/mL)。不同pH的蛋白質溶液在37 ℃水浴搖床內保溫30 min。6000 r/min離心20 min,采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質濃度。蛋白質溶解度表示為上清液中蛋白質占總蛋白質含量的百分比。

1.2.11 F60的乳化性和乳化穩定性測定 參照Poojary等[18]的方法測定F60的乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)。

1.2.12 F60的起泡性和泡沫穩定性測定 稱取0.5 g F60蛋白質樣品,加50 mL Tris-HCl緩沖液(0.2 mol/L,pH8.0)配制成濃度為1%(W/V)的蛋白質溶液,倒入量杯。10000 r/min均質2 min靜置。分別于0和30 min記錄泡沫高度V0和V30。起泡性(FC)和泡沫穩定性(FS)的計算方法如下:

式(3)

式(4)

1.2.13 F60的吸油性測定 稱取0.2 g F60于10 mL離心管內,加入5 mL大豆油,攪拌2 min;10000 r/min離心20 min,去除上清,稱量每管內沉淀與離心管的質量,吸油性(FAC)的計算見以下公式:

式(5)

式中,F0為樣品干重質量(g);F1為樣品干重與試管質量之和(g);F2為沉淀與試管質量之和(g)。

1.2.14 F60的體外解離度測定 參照Poojary等[18]的方法測定F60的體外解離度(IVD)。計算方法如下:

式(6)

式中:N0為未水解樣品中總氮量;N1為酶解后樣品中總氮量。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,每次重復實驗進行至少三次平行實驗。實驗得到的數據用Minitab 16統計軟件進行方差分析。結果表示為平均值±標準偏差,并且當p<0.05時認為差異是顯著的。采用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 白靈菇干粉基本成分測定

白靈菇干粉中含有豐富的粗多糖、蛋白質,含量分別為37.48%±1.50%和22.37%±0.84%;粗纖維與灰分含量分別為10.42%±0.39%、5.77%±0.04%;脂肪含量低,僅占干重的0.64%±0.02%。

2.2 白靈菇蛋白質的制備及粗蛋白中蛋白質與多糖含量

白靈菇菇粉堿性條件下浸提蛋白質,浸提液中蛋白質含量達(2046.76±2.60) mg/100 g菇粉,白靈菇菇粉蛋白提取率為9.15%。曹萌等[19]從棘托竹蒜菌蓋中用0.1 mol/L NaOH蛋白質提取率為11.89%;彭煒等[20]采用超聲波輔助堿法最優工藝提取硒蛋白,提取率為41.13%。較低的提取率可能與食用菌細胞壁組織結構及提取過程中真菌細胞壁的破碎方法有關[21]。

由表1可知,向白靈菇蛋白質提取液中分段加入(NH4)2SO4得FPs,FPs中F60析出率最高,達65.62%,與浸提液中蛋白質濃度越高越易鹽析有關[22]。FPs中蛋白質含量范圍為44.58%～71.58%,多糖含量范圍為25.22%～37.85%。FPs中的蛋白質含量,隨著鹽析飽和度的增大而增大,F90中蛋白質含量最高,達71.58%。

表1 白靈菇蛋白質的析出率及粗蛋白中蛋白質與多糖含量Table 1 Exhalation rate,protein and crude sugar content of pleurotus nebrodensis proteins

2.3 白靈菇蛋白質的理化特性

2.3.1 白靈菇蛋白質的分子量 白靈菇蛋白質的SDS-PAGE圖譜見圖1,白靈菇蛋白質分子質量主要集中在21.5～97.4 kDa之間,蛋白質條帶數與各條帶分子量間存在差異。白靈菇蛋白質組分共同含有分子量為約31 kDa的蛋白質條帶,且F90僅富含分子量為31 kDa的一條蛋白質條帶,表明這種蛋白質是FPs的主要組成;除共同條帶外,F80富含分子量約為50 kDa的大分子量蛋白質條帶,F60富含分子量約為14.4 kDa的小分子量蛋白質條帶。

圖1 白靈菇蛋白質的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profiles of pleurotus nebrodensis proteins

2.3.2 白靈菇蛋白質的二級結構、表面疏水性與二硫鍵含量 對傅里葉紅外變換光譜進行高斯曲線擬合后,獲得白靈菇蛋白質組分的近似二級結構分布,由表2所示。FPs中隨著鹽飽和度的增大,β-折疊結構出現頻率降低,無規則卷曲結構出現頻率增加,α-螺旋與β-轉角結構出現頻率先增加后減小。結果說明,FPs的主要結構為β結構,隨著(NH4)2SO4飽和度的增大,可能導致蛋白質局部変性,蛋白質中的β-折疊向無規則卷曲、α-螺旋和β-轉角結構轉變[23]。

表2 白靈菇蛋白質的二級結構、表面疏水性與二硫鍵含量Table 2 Relative content of the secondary structural features,surface hydrophobicity and disulfide bond of pleurotus nebrodensis proteins

表面疏水性是反映蛋白質表面與極性環境相接觸的疏水基團數目的重要指標[24]。預測不同處理的蛋白質疏水性基團暴露程度的H0如表2所示。FPs中,隨著鹽析過程中鹽飽和度的增加,H0減小;表明F60、F80、F90中與極性環境接觸的疏水性基團含量依次減少;可能與鹽濃度升高會加劇蛋白質局部變性與疏水性基團聚合有關[25]。也可能是受蛋白質中含有的多糖雜質的影響。油-水界面的相互作用由疏水作用主導,油-水界面中蛋白質暴露的非極性疏水基團對蛋白質乳化性產生影響[26],推斷FPs中F60的乳化性、起泡性最優。

二硫鍵是一種共價鍵,能使蛋白質肽鏈的空間結構更為緊密,二硫鍵等基團間的相互作用,為蛋白質產生維持高級結構和功能提供基礎[27]。三種白靈菇蛋白質組分二硫鍵含量范圍為54.77～55.61 μmol/L/g,二硫鍵含量差異不顯著(p>0.05),高于青稞蛋白質[28](42.53～52.54 μmol/L/g)中的二硫鍵含量;結果表明,F60、F80、F90具有較高且相近的蛋白質穩定性。

2.3.3 白靈菇蛋白質的內源熒光光譜 在激發波長為280 nm的條件下,內源熒光可反映酪氨酸與色氨酸殘基所處的蛋白質環境[27],被用于研究蛋白質三級結構的改變[29]。

如圖2所示,三種白靈菇蛋白質的發射峰均在344 nm左右。FPs的發射光譜峰值,隨著鹽飽和度的增大而減小,FPs中出現高度變性的蛋白質可能性增大,隨著蛋白質變性,導致大量酪氨酸與色氨酸殘基到達親水性環境。同時,可能與蛋白質中β-折疊結構含量有關,折疊結構含量越高,可將酪氨酸與色氨酸更加緊密地包裹在蛋白質內核疏水性區域[16]。進而推斷,FPs間的蛋白質三級結構存在差異。

圖2 白靈菇蛋白質組分內源熒光光譜圖Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of pleurotus nebrodensis proteins

2.4 F60的功能特性

由表1可知,F60的析出率最高,達65.62%;F60較F80、F90具有較高的表面疏水性,進一步測定其功能特性。

2.4.1 F60的溶解度 由圖3可知,在pH為2.2～3.8的范圍內,隨著pH升高,F60的溶解度減小;在pH為4.2～8.0的范圍內,隨著pH升高,F60的溶解度增大,在pH8.0的溶解度最大(27.32%)。在pH為2.2～8.0的范圍內,F60呈現兩次降低、升高趨勢,分別在pH3.8、pH4.2溶解度最低,由此推斷F60中富含兩種等電點分別為pH3.8與4.2的蛋白質組分。

圖3 F60蛋白質在不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶解性Fig.3 Solubility of pleurotus nebrodensis proteins of F60 in phosphate-citrate buffer at different pH values

2.4.2 F60的乳化性、起泡性、持油性及體外解離度 由表3可知,蛋白質的功能特性與蛋白質的感官特性密切相關,目前對食用菌蛋白質的功能特性研究較少,陳雪洋等[30]對杏鮑菇蛋白質的提取與功能特性進行研究,樣品溶解度為11.40%,乳化及乳化穩定性指數分別為52.81 m2/g與97.75 min,起泡性與泡沫穩定性分別118.00%與70.26%,持油性為4.22 g/g樣品。與杏鮑菇蛋白質相比,除乳化性(EAI、ESI)與FAC,F60的溶解度(27.13%,pH7.0)、FC與FS均優于杏鮑菇蛋白質。此外,F60的體外解離度高于香榧籽蛋白質[18](58.05%～59.05%),易消化水解。F60具有較好的溶解性、起泡性、易消化水解,具有潛在的應用價值。

表3 F60的乳化性、起泡性、持油性及體外解離度Table 3 The functional properties of F60

3 結論

白靈菇干粉中含有豐富的粗多糖、蛋白質,含量分別為37.48%和22.37%;脂肪含量僅占干重0.64%。白靈菇是一種高蛋白、高多糖,低脂肪的食用菌。由堿浸提、分段鹽析法制備的FPs,其析出率、蛋白質純度與理化特性存在差異。F60析出率顯著高于F80、F90(p<0.05);F90的蛋白質純度顯著高于F60、F80(p<0.05)。FPs間的二硫鍵含量無顯著性差異(p>0.05),FPs的穩定性相近。FPs的蛋白質條帶中共同含有分子量約為31 kDa的蛋白質條帶,但FPs間的蛋白質條帶組成存在差異。F60較F80、F90富含分子量為14.4 kDa的蛋白質條帶,具有較高的表面疏水性與熒光發射光譜峰值,β-折疊結構出現頻率更高。F60具有優良的溶解性、起泡性、易消化水解,具有潛在的應用價值。白靈菇蛋白質是一種可用于食品加工的優質蛋白質資源。