羊肉火腿加工過程中脂質(zhì)氧化及 內(nèi)源抗氧化體系變化

王勇勤,郭 新,黃笠原,盧士玲,王 斌,王慶玲,*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832003; 2.新疆綠翔牧業(yè)有限責(zé)任公司,新疆額敏834600)

新疆羊肉因綠色、無污染深受區(qū)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛,然而目前羊肉主要以鮮食消費(fèi)為主,羊肉加工制品及其他相關(guān)產(chǎn)品相對(duì)匱乏。羊肉火腿是新疆穆斯林民族的特色食品,在腌制、發(fā)酵、成熟過程中,脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶系的作用下,產(chǎn)生許多易于消化吸收的小分子物質(zhì),如小分子肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等,并形成了大量揮發(fā)性物質(zhì),賦予了羊肉火腿特有的香味[1]。然而,目前羊肉火腿的加工多為手工作坊模式,加工過程對(duì)自然環(huán)境的依賴性較強(qiáng),導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定、風(fēng)味差異大[2]。夏博能[3]研究表明傳統(tǒng)金華火腿相較于現(xiàn)代化工藝金華火腿具有較好香味,但含有三甲胺氮等有害物質(zhì),存在安全隱患。

脂質(zhì)氧化是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品加工中的重要生化反應(yīng),脂質(zhì)氧化程度與原料脂質(zhì)組成、加工條件(溫濕度)、光照等條件密切相關(guān),適量的脂質(zhì)氧化能夠改善火腿風(fēng)味,增加消費(fèi)者接受度[4];而脂質(zhì)氧化過度會(huì)產(chǎn)生不愉快氣味,甚至氧化酸敗,危害人體健康[5]。陸瑞琪[6]研究證明了金華火腿加工過程中脂質(zhì)氧化在發(fā)酵初期迅速上升，并在風(fēng)干期有最大值,成熟期略有回落的變化規(guī)律,張萬剛等[7]對(duì)傳統(tǒng)工藝和新工藝金華火腿中抗氧化肽進(jìn)行研究,證明了傳統(tǒng)工藝中有更高含量的抗氧化肽,但還原能力與新工藝抗氧化肽還原力相當(dāng)。

本課題對(duì)羊肉火腿加工關(guān)鍵工藝點(diǎn)的脂質(zhì)氧化及抗氧化體系能力進(jìn)行評(píng)價(jià),揭示火腿加工過程中脂質(zhì)氧化及自身抗氧化能力對(duì)火腿品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮羊后腿 石河子市好家鄉(xiāng)超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、甲基-β-環(huán)糊精(RMCD)、丙酮等 均為分析純,新疆恒朝生物技術(shù)有限公司。

IKA-T25型高速分散器 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;SP-725型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;X7型酶標(biāo)儀 基因有限公司;FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 日本東京Rikakikai公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肉火腿加工工藝及取樣 新鮮羊后腿→冷涼修整→加鹽腌制→浸泡洗刷→晾掛→發(fā)酵→成熟→成品[8]。

操作要點(diǎn):鮮腿4 ℃預(yù)冷48 h腌制,鮮腿重的6.5%鹽量,每次間隔2 d分5次搓在鮮腿表面,0～30 d為腌制期,腌制溫度為6 ℃、RH為65%;30～60 d為晾掛風(fēng)干期,風(fēng)干溫度為10 ℃、RH為70%;60～90 d為發(fā)酵前期,發(fā)酵溫度為20 ℃、RH為70%,90～120 d為發(fā)酵后期,發(fā)酵溫度為25 ℃、RH為75%;120～180 d為成熟期,成熟溫度為28 ℃、RH為70%,其中RH為相對(duì)濕度[8]。

取樣:從六個(gè)關(guān)鍵工藝點(diǎn)取樣,分別是原料腿(第0 d)、腌制期(第30 d)、風(fēng)干期(第60 d)、發(fā)酵結(jié)束期(第120 d)、成熟中期(第150 d)、成熟結(jié)束期(第180 d)取樣,置于-80 ℃冷凍保藏,備用。

1.2.2 氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 硫代巴比妥酸值(TBARS)的測(cè)定 參照Flores M等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2 過氧化值(POV)的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.227-2016進(jìn)行測(cè)定[10]。

1.2.2.3 羰基值、雙烯值的測(cè)定 2 g肉樣加入 40 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1,v/v),用高速分散器4000 r/min勻漿1 min,靜置過濾,加入0.7% NaCl溶液8 mL振蕩,靜置 2 h,移去上層液體,將下層液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,得到純油樣,精確稱量后,以環(huán)己烷溶解油樣,并以環(huán)己烷作為空白對(duì)照組,分別在215、275、232 nm 處測(cè)吸光度,羰基值、雙烯值分別用A275/A215,A232/A215計(jì)算[11]。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)定

1.2.3.1 樣品處理 將各個(gè)時(shí)期樣品破碎后凍干,充分去除水分后用于抗氧化能力的測(cè)定。取冷凍干燥后樣品0.4 g于離心管中,加入10 mL正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v),25 ℃、150 r/min搖床震搖1 h后，3000 r/min離心5 min,收集有機(jī)相氮?dú)獯蹈?殘余物用于親脂性抗氧化物質(zhì)的測(cè)定;向離心管殘?jiān)屑尤?0 mL 80%乙醇,25 ℃、150 r/min搖床震搖1 h后，3000 r/min離心5 min,收集上清液并在氮吹儀下回收乙醇,殘余物用于親水性抗氧化物質(zhì)的測(cè)定[12]。

向親脂性提取物中加入0.5 mL丙酮和1.5 mL 7%甲基-β-環(huán)糊精(RMCD)溶液;向親水性提取物加入2 mL pH7.4 的75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液;每組測(cè)定三組重復(fù)[12]。

1.2.3.2 還原力測(cè)定 向試管中依次加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)2.5 mL,1.2.3.1樣品溶液0.5 mL,1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混合體系于50 ℃孵育30 min,快速冷卻,再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL加入去離子水2.5 mL和0.1% FeCl3溶液 0.5 mL,放置 10 min,以蒸餾水作為空白對(duì)照,于700 nm處測(cè)定其吸光度[13]。

1.2.3.3 羥自由基清除率的測(cè)定 取1.0 mL鄰二氮菲無水乙醇(1.865 mmol/L)溶液,加入1.0 mL 0.2 mol/L的pH7.4磷酸鹽緩沖液,混勻,加入1.2.3.1提取液1 mL,充分混勻后分別加入1.865 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液1.0 mL、0.1% H2O21.0 mL于試管中,測(cè)量各組樣品溶液的吸光度值為As,以去離子水代替樣品作為空白測(cè)量吸光度值為Ab,以去離子水替代0.1% H2O2作為損傷組,測(cè)其吸光度值為An,脂溶性和水溶性樣品的測(cè)定過程相同[13]。樣品羥自由基清除率按以下公式進(jìn)行計(jì)算:

1.2.3.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取20 μL 1.2.3.1水溶性樣品,80 μL去離子水和100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液于96孔微孔板中,于37 ℃恒溫孵育45 min,于517 nm波長下測(cè)定其吸光度值;脂溶性樣品的測(cè)定:將上述操作中去離子水更換為80 μL的95%乙醇,其余條件和操作步驟相同,以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品建立回歸方程(水溶性標(biāo)準(zhǔn)曲Y=-1.0244X+0.3681(R2=0.996);脂溶性標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-1.2205X+0.5002(R2=0.9969)),結(jié)果用Trolox當(dāng)量濃度表示[12]。

1.2.3.5 ABTS自由基清除率的測(cè)定 取20 μL 1.2.3.1水溶性樣品,80 μL去離子水和100 μL磷酸鹽緩沖液稀釋的ABTS溶液于96孔微孔板中,于37 ℃恒溫孵育5 min后，于734 nm下測(cè)定其吸光度值;脂溶性樣品的測(cè)定將上述操作過程中磷酸鹽緩沖液更換為80 μL的95%乙醇,其余條件和操作步驟相同,以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品建立回歸方程(水溶性標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-0.6635X+0.2557(R2=0.9969);脂溶性標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-0.6788X+0.6388(R2=0.9975)),結(jié)果用Trolox當(dāng)量濃度表示[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肉火腿加工過程中TBARS的變化

硫代巴比妥酸值是油脂氧化酸敗的重要指標(biāo)[14],對(duì)火腿加工過程中TBARS監(jiān)測(cè)結(jié)果見圖1。

由圖1可知,羊肉火腿加工過程中TBARS值先呈現(xiàn)顯著上升(p<0.05),而后下降并逐漸趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。從原料至風(fēng)干期結(jié)束(60 d)，TBARS值呈現(xiàn)顯著上升(p<0.05)并達(dá)到最大值0.34 mg/kg,其原因是腌制及風(fēng)干期水分大量散失,水分活度降低,脂質(zhì)氧化加劇,造成火腿中不飽和脂肪酸大量被氧化導(dǎo)致丙二醛不斷累積[15];發(fā)酵期相較于風(fēng)干期結(jié)束(60 d)，TBARS值略有下降,隨后在成熟中期(150 d)至成熟期結(jié)束(180 d)趨于穩(wěn)定,主要原因是風(fēng)干期以后溫度上調(diào)至20 ℃,溫度的變化促進(jìn)了部分內(nèi)源蛋白水解產(chǎn)物向小肽、游離氨基酸轉(zhuǎn)變[16],產(chǎn)生具有抗氧化功能的內(nèi)源物質(zhì);此外醛類進(jìn)一步氧化生成醇和羧酸等物質(zhì),也是硫代巴比妥酸值下降的原因[17]。

圖1 羊肉火腿加工過程中TBARS的變化Fig.1 Changes of TBARS value during mutton ham processing

2.2 羊肉火腿加工過程中過氧化值(POV)的變化

氫過氧化物是油脂自動(dòng)氧化的主要初級(jí)產(chǎn)物,POV值主要用來衡量油脂氧化初期的氧化程度,當(dāng)油脂深度氧化時(shí),氫過氧化物的氧化速度超過了生成速度,POV值則會(huì)降低[14]。

由圖2可以看出,原料腿到風(fēng)干期結(jié)束(60 d)，過氧化值(POV)迅速增長,但在發(fā)酵期結(jié)束(120 d)至成熟期結(jié)束(180 d)維持穩(wěn)定。原料腿POV值較低,主要是由于原料中水分含量較高、脂質(zhì)氧化較輕,隨著腌制過程的進(jìn)行肌肉內(nèi)水分流失,油脂氧化加劇,POV值上升,后期維持平穩(wěn)可能是由于初級(jí)氧化產(chǎn)物向次級(jí)氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,也可能是脂質(zhì)氧化程度維持平穩(wěn)[18]。雖然脂肪初級(jí)氧化產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味不產(chǎn)生直接影響,但卻是重要的風(fēng)味前體物質(zhì),這些中間產(chǎn)物隨著累積會(huì)進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)生成酮、醛、酸等低分子物質(zhì)[19],所以脂肪氧化是羊肉火腿風(fēng)味的重要來源。本研究羊肉火腿中POV值(按脂肪計(jì))小于國標(biāo)所規(guī)定的0.25 mg/100 g[10]。

圖2 羊肉火腿加工過程中過氧化值(POV)含量的變化Fig.2 Changes of POV content during mutton ham processing

2.3 羊肉火腿加工過程中羰基值和雙烯值的變化

羰基值是衡量肉制品品質(zhì)和質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,是指油脂氧化分解生成的酮、醛等物質(zhì)含量的多少[20],雙烯值則是評(píng)價(jià)不飽和脂肪酸中共軛雙鍵多少的指標(biāo)[14]。

由圖3可知,羰基值和雙烯值整體呈上升趨勢(shì),與原料肉相比,雙烯值在腌制期呈現(xiàn)明顯下降,主要原因可能是腌制時(shí)間延長,羊腿內(nèi)水分逐漸散失,不飽和脂肪酸發(fā)生化學(xué)性或酶促性氧化反應(yīng)所致[20];雙烯值在風(fēng)干期結(jié)束(60 d)有最大值1.14,可能是風(fēng)干期羊腿與空氣中氧氣充分接觸而導(dǎo)致脂肪氧化程度加深;羰基值變化則較為平緩,在風(fēng)干期結(jié)束(60 d)有最大值0.193,因?yàn)樵诔墒爝^程中羰基化合物會(huì)轉(zhuǎn)化成醇及其他揮發(fā)性風(fēng)味化合物,這體現(xiàn)了羊肉火腿風(fēng)味緩慢形成的過程,此結(jié)果與馬艷梅等[8]研究結(jié)果相似。

圖3 羊肉火腿加工過程中羰基值和雙烯值的變化Fig.3 Changes of carbonyl and diene values during mutton ham processing

2.4 火腿內(nèi)源抗氧化體系還原力評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)火腿加工中關(guān)鍵工藝點(diǎn)的水溶性及脂溶性抗氧化體系進(jìn)行還原力測(cè)定,結(jié)果見圖4。

圖4 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物質(zhì)還原力的變化Fig.4 Changes of reducibility of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由圖4可知，水溶性抗氧化物質(zhì)的吸光值呈現(xiàn)顯著(p<0.05)下降,表明其還原力不斷降低,其原因可能是具有抗氧化能力的蛋白(肽)在加工中尤其是成熟期發(fā)生氧化現(xiàn)象。脂溶性抗氧化物質(zhì)的還原力先上升而在150 d后略微下降,并且在成熟中期(150 d)具有最強(qiáng)還原力,主要原因是在前期加工中，內(nèi)源蛋白酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗氧化小肽和氨基酸積累[16],而在成熟后期(150～180 d)，此類抗氧化物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化成大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[21],因而還原力略有下降。

2.5 火腿加工過程中羥自由基清除率的變化

羥自由基是引起食品脂肪和蛋白質(zhì)氧化的重要因素,影響食品的品質(zhì)和貨架期[22],對(duì)羊肉火腿加工過程中羥自由基清除率的測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物質(zhì)羥自由基清除率的變化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由圖5可以看出，羥自由基清除率與抗氧化體系還原力具有類似的變化趨勢(shì),火腿的整個(gè)加工過程中,脂溶性抗氧化體系羥自由基清除率呈顯著(p<0.05)上升趨勢(shì),在成熟結(jié)期結(jié)束時(shí)(180 d)有最大清除率24.2%,有研究表明可能是加工過程中蛋白水解產(chǎn)生了脂溶性小肽、氨基酸所致,如含有色氨酸,酪氨酸等帶酚類基團(tuán)的片段[23],具有較強(qiáng)的自由基清除效果。研究表明抗氧化肽分子中含脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸時(shí),在清除自由基方面有重要作用[24]。水溶性體系的羥自由基清除率呈下降趨勢(shì),在成熟期結(jié)束(180 d)低至12.8%,其原因可能是加工過程中水分含量降低導(dǎo)致抗氧化能力的下降。此結(jié)果與邢路娟等[25]的研究略有差異,可能與加工原料、溫濕度條件、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等有關(guān)。

2.6 火腿加工過程中DPPH自由基清除率的變化

圖6表示水溶性抗氧化物質(zhì)和脂溶性抗氧化物質(zhì)清除DPPH自由基的變化趨勢(shì)。

圖6 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物質(zhì)DPPH自由基清除率的變化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由圖6可知，在原料羊腿中水溶性抗氧化物的DPPH清除能力明顯高于脂溶性抗氧化物質(zhì),可能是由于原料腿中水分含量較高,含有一些具有抗氧化能力的水溶性短肽和游離氨基酸[26]。加工過程中脂溶性體系的DPPH清除率持續(xù)增加,不僅是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物積累的結(jié)果,可能與羊肉火腿加工中磷脂的變化也具有相關(guān)性。磷脂酰基鏈上的脂肪酸水解時(shí)產(chǎn)生的游離多不飽和脂肪酸也對(duì)抗氧化能力也具有一定貢獻(xiàn)[27];成熟期清除率略有下降,與多不飽和脂肪酸的氧化有關(guān)。水溶性抗氧化物質(zhì)在整個(gè)加工過程中明顯下降,而脂溶性抗氧化物質(zhì)則是有升有降,成熟期結(jié)束(180 d),水溶性抗氧化物質(zhì)和脂溶性抗氧化物抗氧化能力相當(dāng)。

2.7 火腿加工過程中ABTS自由基清除效果

ABTS法是一種用于體外測(cè)定物質(zhì)抗氧化能力的方法。圖7表示水溶性抗氧化物質(zhì)和脂溶性抗氧化物質(zhì)清除ABTS自由基的變化趨勢(shì)。

圖7 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物質(zhì)ABTS自由基清除率的變化Fig.7 Changes of ABTS free radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由圖7可知,脂溶性體系對(duì)ABTS的清除效果整體呈上升趨勢(shì),而水溶性體系呈下降趨勢(shì)。脂溶性抗氧化物質(zhì)清除ABTS自由基能力在發(fā)酵期結(jié)束(120 d)最強(qiáng),主要原因是隨著發(fā)酵期溫度升高,羊肉火腿中內(nèi)源蛋白酶活性逐漸增強(qiáng),這大大加快了蛋白分解生成具有抗氧化能力的小肽和氨基酸的速度[28],抗氧化能力增強(qiáng),增大了ABTS自由基清除能力;水溶性抗氧化物質(zhì)在風(fēng)干期結(jié)束(60 d)至發(fā)酵期結(jié)束(120 d)有微小上升,說明此階段水溶性抗氧化物質(zhì)生成速度大于氧化速度;在成熟期二者均呈下降趨勢(shì),可能與加工后期的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化相關(guān)。

3 結(jié)論

通過對(duì)羊肉火腿關(guān)鍵工藝點(diǎn)POV、TBARS、羰基值和雙烯值的研究來評(píng)價(jià)火腿加工過程中的脂質(zhì)氧化現(xiàn)象,結(jié)果表明，火腿加工在風(fēng)干期結(jié)束(60 d)達(dá)到脂質(zhì)氧化的最高值,而在后期脂質(zhì)氧化程度下降并趨于平穩(wěn);對(duì)水溶性及脂溶性內(nèi)源抗氧化體系的測(cè)定表明，火腿加工過程中抗氧化能力呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,脂溶性抗氧化體系較水溶性抗氧化體系表現(xiàn)出更高的抗氧化能力。