量子化學計算 對自由基清除肽的構效關系

董夢依，王倩蕓，劉科梅，陸 豫，余 勃,*

(1.南昌大學資源環境與化工學院，江西南昌 330031； 2.南昌大學食品科技學院，江西南昌 330031； 3.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌 330047)

本研究選取12種具有代表性的短肽鏈RSP作為研究對象,采用半經驗AM1和密度泛函理論(DFT)等量子化學計算方法對這些多肽清除自由基活性進行理論計算研究,從而對RSP中的活性基團進行定性判斷。同時通過試驗測定這些多肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除活性,探討RSP自由基清除能力與量化參數之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)試劑盒 美國Sigma;天冬氨酸-谷氨酸-谷氨酸(Asp-Glu-Glu,DEE)、甘氨酸-丙氨酸-組氨酸(Gly-Ala-His,GAH)、甘氨酸-甘氨酸-谷氨酸(Gly-Gly-Glu,GGE)、亮氨酸-丙氨酸-精氨酸(Lue-Ala-Arg,LAR)、色氨酸-脯氨酸-亮氨酸(Trp-Pro-Lue,WPL)、酪氨酸-亮氨酸-谷氨酸(Tyr-Lue-Glu,YLE)、甘氨酸-丙氨酸-色氨酸-丙氨酸(Gly-Ala-Trp-Ala,GAWA)、絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸(Ser-Ser-Gly-Glu,SSGE)、組氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-谷氨酸(His-Val-Thr-Glu-Glu,HVTEE)、亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-組氨酸-組氨酸(Lue-Lue-Pro-His-His,LLPHH)、甘氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-組氨酸(Gly-Ala-Lue-Ala-Ala-His,GALAAH)、酪氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Lue,YFYPEL)片段(純度>95%) 上海楚肽生物技術有限公司進行固相合成而得;Tris-HCl 緩沖液(pH=8.2)、鄰苯三酚、無水乙醇 天津市大茂化學試劑廠。

TU-1810PC紫外可見光分光光度計 北京普析公司;Finnpipette微量移液器 美國熱電公司;T型恒溫水浴鍋 德國LAUDA公司;ER-180A型電子分析天平 日本AND公司。

1.2 自由基清除能力的測定

式中:ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率(吸光度每分鐘的增值);ΔA為加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率(吸光度每分鐘的增值)。

1.2.2 羥自由基(·OH)清除活性的測定 根據Chen[14]等的實驗方法。用蒸餾水溶解多肽至濃度1 mg/mL。分別取多肽溶液、6 mmol/L的FeSO4溶液以及6 mmol/L的H2O2溶液1 mL,混合搖勻后靜置10 min,再加入用乙醇溶解的6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL,搖勻后再靜置30 min,最后用紫外分光光度計測定溶液在510 nm下的吸光值,以二次蒸餾水為對照。

·OH清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

其中:A0為用蒸餾水代替多肽時測得的吸光值;Ai為不同多肽濃度下測得的吸光值;Aj為用蒸餾水水代替水楊酸時，不同多肽濃度下測得的本底吸光值。

1.2.3 二苯基-三硝基苯肼(DPPH·)清除活性的測定 根據Je[15]、熊雙麗[16]等的實驗方法。用蒸餾水溶解多肽至濃度1 mg/mL。取5 mL多肽溶液與5 mL 1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液充分混合,避光反應30 min,取樣在517 nm下測定吸光值Ai。用等體積的無水乙醇替代DPPH溶液作空白對照,等體積的蒸餾水替代樣品溶液作為對照。

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

其中:Ai為樣品組吸光值;Aj為空白組吸光值;A0為對照組吸光值。

1.3 量子化學計算方法

本文采用Gaussian09程序對十二種多肽進行量子化學計算。通過GaussView構建分子模型,使用半經驗算法AM1對多肽結構進行初步優化,再利用高精度的密度泛函法(DFT,Density Functional Theory)B3LYP/6-31G(d)基組進一步地進行頻率分析與結構優化,直到無虛頻后,確定最終的分子構型,并計算其單點能,對得到的NBO凈電荷分布、前線軌道系數等量化參數數據進行分析[17]。

2 結果與分析

2.1 多肽清除自由基活性

將12種多肽對3種自由基的清除率分別進行排序。

·OH清除率:HVTEE>GGE≈GALAAH≈GAWA>LAR>LLPHH>>YFYPEL>WPL≈SSGE>GAH>DEE>YLE

表1 十二種多肽的自由基清除率Table 1 The radical scavenging rate of

2.2 凈電荷分布

分子結構理論認為,原子間的電荷差值越大,電子越容易發生躍遷,因此電荷差值較大的位點為分子活性位點,更容易發生化學反應[18-19]。通過計算12種多肽分子上各原子的凈電荷,發現電荷差值大的位點多集中在Trp的吲哚結構、Tyr的酚羥基結構、Ser與Thr的羥基結構、His的雜環結構,以及氨基的氮原子、羧基的氧原子和肽鍵上,這些都是多肽的活性位點。

這里選取了HVTEE與YFYPEL的部分NBO凈電荷分布,見圖1與表2。可以看出,HVTEE與YFYPEL中,末端氨基N原子電荷值都高達-0.8,與旁邊氫原子電荷差值超過了1,活性很強;末端羧基C原子電荷分別為0.82862、0.77980,與帶負電荷的O原子電荷差值達到1.4;肽鍵上C原子電荷值為0.66左右,與帶負電荷N原子、O原子都具有很大的電荷差值。可見,不同氨基酸序列的多肽結構中,肽鍵、末端氨基、末端羧基都是主要的活性位點。在HVTEE上,His雜環結構中N原子與H原子之間的電荷差值為0.9,相比雜環上其他原子間電荷差值(0.3/0.4左右)要大,說明N-H鍵較易斷裂,釋放活潑性氫與自由基結合,進行抽氫反應;而Glu的-COOH結構中,C原子與-OH上的O原子間具有最大的電荷差值;Thr的-OH結構中,O原子電荷值達到了-0.77670,是帶凈電荷最大的O原子,與H原子電荷差值達到1.2,因此O-H鍵容易發生解離。在YFYPEL上,Tyr酚羥基結構中O原子的凈電荷值最大,O-H鍵易斷裂與自由基結合,達到清除自由基的目的。這些活性基團都能促進肽清除自由基。

圖1 HVTEE與YFYPEL的結構圖Fig.1 The structure chart of HVTEE and YFYPEL注:圖中序數與表2中序數一致。

表2 HVTEE與YFYPEL的部分NBO凈電荷分布Table 2 The distribution of atomic net charge of HVTEE and YFYPEL

2.3 前線分子軌道分布

分子軌道理論認為,最高占據軌道能與分子的給電子能力密切相關,而最低空分子軌道能則表征了分子接受電子的能力[20]。12種多肽前線分子軌道分布圖見圖2。從圖中可以看出,最高占據軌道能多分布在末端氨基及靠近氨基端的活性基團上,而最低空分子軌道能則主要分布在端鏈羧基及靠近羧基端的基團上。而含有Trp、Tyr、His、Arg等氨基酸的多肽,其最高占據軌道的電子云主要集中在這些氨基酸上。如WPL、GAWA等帶Trp的多肽,吲哚環N-H結構上的電子云密度最大;YLE、YFYPEL等帶Tyr的多肽,酚羥基上的電子云密度最大;LAR等帶Arg的多肽,胍基上的電子云密度最大;GAH、LLPHH等帶His的多肽,雜環上的電子云密度大,說明這些基團都是自由基清除反應中重要的活性位點。而含有Glu、Asp酸性氨基酸的多肽,如DEE、GGE、HVTEE等,其最低空分子軌道的電子云密度受到Glu、Asp中-COOH的影響,提高了其接受電子的能力。對比GAH、HVTEE、GALAAH、LLPHH的最高占據軌道,GAH、HVTEE中電子云都集中在His上;而GALAAH中電子云集中在末端氨基上,原因可能是His距離氨基端太遠;而含有兩個His的LLPHH,電子云密度主要集中在靠近氨基端的His上,由此推測末端氨基與其他活性基團產生共軛效應,提高了其他基團的給電子能力。

圖2 十二種多肽的前線分子軌道分布圖Fig.2 The frontier molecular orbital of twelve kinds of peptides注:a:DEE；b:YLE;c:GAH;d:GGE;e:LAR;f:WPL;g:SSGE;h:GAWA;i:HVTEE; j:LLPHH;k:GALAAH;l:YFYPEL,H為HOMO軌道圖,L為LUMO軌道圖。

2.4 能隙(Egap)與清除自由基活性關系

能隙即最高占據軌道能(EHOMO)與最低空分子軌道能(ELUMO)之差,是指分子從基態到激發態所需要的能量,是抗氧化劑清除自由基能力的一個重要量化參數。能隙越小,則形成反應所需的活化能越小,分子中的電子越容易發生躍遷,分子的自由基清除活性越強[19]。十二種多肽的能隙值見表3。根據能隙值推測其對自由基清除活性能力由強到弱排序為:HVTEE>GALAAH>WPL>SSEG>GAWA>LAR>YFYPEL>LLPHH>GGE>GAH>DEE>YLE。這與RSP清除DPPH·的能力順序一定程度上吻合,推測通過能隙值可以大致判斷出多肽清除DPPH·的活性大小。

表3 十二種多肽的前線分子軌道能隙值Table 3 The frontier molecular orbital energy of twelve kinds of peptides

3 結論

根據量子化學理論計算我們發現了RSP的活性位點,但具體的RSP清除自由基機理尚不明確。量子化學計算作為預測手段在多肽清除自由基的構效關系、作用機制上,還具有很大的探討空間。