響應面法優化超聲提取杏鮑菇皂苷

林國榮,吳畢莎,蘇彩鳳

(莆田學院環境與生物工程學院,福建省新型污染物生態 毒理效應與控制重點實驗室,福建莆田 351100)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹蒼耳,隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycete subdivision),層菌綱(Hymenomycetes),無隔擔子菌亞綱(Homobasidiomycetidae),傘菌目(Agaricales),側耳科(Pleurotaceae),側耳屬(Pleurotus)。杏鮑菇菌肉肥厚,營養豐富,具有杏仁香味和鮑魚味,故稱杏仁鮑魚菇。其子實體色澤雪白,質地脆嫩,也稱“雪茸”,又有“平菇王”、“干貝菇”、“草原上的美味牛肝菌”之美譽。杏鮑菇入藥不僅有降血壓和降血脂的作用[1]，還對某些腫瘤有預防和抑制作用[2],具有提高人體免疫力、抗動脈粥樣硬化、抗氧化的功能[3],被稱為新世紀的健康食品。杏鮑菇寡糖含量很豐富,與雙歧桿菌共用,有改善腸胃功能和美容的效果[4]。皂苷(saponin)又稱:堿皂體、皂素、皂甙、皂角苷或皂草苷。“皂苷”一詞由英文名Saponin意譯而來,英文名則源于拉丁語的Sapo,意為肥皂。皂苷(Saponin)是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷,由皂苷元和糖構成;除用作藥物外,皂苷還可以作為高級化妝品和食品添加劑,如作為殺菌劑、抗氧化劑、發泡劑等,在化妝品和食品工業中具有廣泛的應用。

關于杏鮑菇研究報道主要集中于品種選育、高產栽培及商品化等方面,而對于杏鮑菇皂苷的報道相對較少見。由于超聲波輔助提取法具有方便、快速、簡單、安全、易于實現工業化等優點[5-6],并且寧波等[7]運用響應曲面法優化超聲波提取玉竹總皂苷的工藝研究和董妙音等[8]運用響應面法優化超聲波輔助提取文冠果種皮總皂苷的工藝,這些前人研究都給超聲提取提供了有力依據。本研究采用超聲波輔助提取,響應面優化工藝，確定超聲提取杏鮑菇皂苷的最佳條件,為杏鮑菇皂苷的發展前景提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 市售,洗凈、切片、置于80 ℃烘箱中烘干,用粉碎機粉碎過100目篩，粉末備用;香草醛、濃硫酸、甲醇等 均為分析純;人參皂苷標準品 中國生物制品有限公司。

Sartorius BS 210S電子天平 Sartorius公司;UV 1240型紫外可見分光光度計 日本島津公司;SHB-III型循環水式多用真空泵 河南鄭州長城科工貿有限公司;KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;雷磁pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取人參皂苷15.0 mg,用甲醇定容至50 mL容量瓶中,配制濃度為0.3 mg/mL,分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5支具塞試管中,將試管置于冷水浴中,分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL甲醇后,再加入0.5 mL 0.5%香草醛和2.5 mL硫酸,振蕩均勻,混合物靜置反應15 min,冷卻至室溫,在另一試管中加入1.0 mL甲醇,其他條件與上述一致,作為空白對照。于OD580 nm處測定吸光度,以皂苷濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 皂苷含量的測定方法 采用香草醛—濃硫酸比色法測定，并稍作改進[9]。取10 mL干凈試管,精密加入各提取液1 mL,0.5%香草醛溶液0.5 mL以及濃硫酸2.5 mL,振蕩均勻,混合物靜置反應15 min,冷卻至室溫?？瞻讓φ諡樗尤?.5%香草醛溶液和濃硫酸2.5 mL,測定OD580 nm吸光度,計算皂苷得率。

皂苷得率(mg/g)=(OD580 nm+ b)V/(5.0k)

其中:OD580 nm為試樣的吸光度;b為標準曲線Y軸上截距;V 為濾液的體積,L;k為標準曲線的斜率;5.0 為每份杏鮑菇樣品的重量,g。

1.2.3 單因素實驗 采用單因素實驗法從液固比、提取溫度、超聲提取時間及提取液pH四個方面研究杏鮑菇皂苷的超聲波提取工藝。

準確稱取5.0 g杏鮑菇粉末于250 mL錐形瓶中,固定其他三個條件如超聲提取時間20 min、液固比10∶1 mL·g-1、提取溫度65 ℃和提取液pH為6.2,以超聲提取時間為10、20、30、40、50 min;液固比分別為5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1 (mL·g-1);提取溫度為45、55、65、75、85 ℃;提取液pH為6.2(原液)、7.2、8.2、9.2、10.2;加水并用保鮮膜封口，超聲輔助提取杏鮑菇皂苷。

1.2.4 響應面優化設計 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理[10],將超聲提取時間、液固比、提取溫度和提取液pH各因素分別用A、B、C、D來代表,以杏鮑菇皂苷得率為因變量,采用四因素三水平的響應面設計法(見表1),確定最佳提取工藝條件。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 人參皂苷標準曲線的繪制

以人參皂苷濃度(μg·mL-1)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線如圖1,吸光度Y與濃度X之間的回歸方程為:Y=0.0062X-0.0207,R2=0.9972,線性范圍為0～60.0 μg·mL-1。

圖1 人參皂苷標準曲線Fig.1 Standard curve of saponins

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 超聲提取時間對杏鮑菇皂苷得率的影響 由圖2可知,超聲提取時間為10～30 min時,提取率不斷上升,而且上升趨勢很快,30 min左右達到最高峰,造成這種現象的原因可能是：剛開始時物料與提取液充分接觸,導致提取率越來越高;隨后從30～50 min呈下降趨勢,這是由于隨著時間的延長,物料浸提產生的雜質給提取帶來阻礙,導致得率下降。由圖2可以看出,杏鮑菇皂苷的最適提取時間為30 min左右。

圖2 超聲提取時間對杏鮑菇皂苷得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic extraction time on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.2 液固比對杏鮑菇皂苷得率的影響 由圖3可以看出,當液固比為5∶1 mL·g-1時，杏鮑菇皂苷得率最低,可能是因為這時的液固比較低,溶劑不能完全把杏鮑菇粉末浸透;隨后液固比由5∶1～10∶1 mL·g-1之間,皂苷得率不斷上升,而在10∶1～15∶1 mL·g-1之間又呈下降趨勢,且下降趨勢比上升趨勢稍緩慢,這是因為隨著液固比的增大,提取液對杏鮑菇粉末的浸提已達到完全,且隨著液固比繼續加大,同時也增加了浸提液的蒸發，得率降低。綜上結果,最適的液固比是10∶1 mL·g-1左右。

圖3 液固比對杏鮑菇皂苷得率的影響Fig.3 Effects of liquid-feed ratios on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.3 提取溫度對杏鮑菇皂苷得率的影響 從圖4可知,溫度為45～65 ℃時,杏鮑菇皂苷的得率不斷上升,在65 ℃時達到最大,說明此溫度下杏鮑菇皂苷得率達到最高,若繼續加大液料比可能會造成雜質競爭、溶劑浪費等現象,從而使得率不升反降,所以在65～85 ℃時，得率呈緩慢下降趨勢。因此,杏鮑菇皂苷的最適提取溫度該是65 ℃左右。

圖4 提取溫度對杏鮑菇皂苷得率的影響Fig.4 Effects of temperatures on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.4 提取液pH對杏鮑菇皂苷得率的影響 由圖5可以看出,當提取液pH在6.2～8.2之間時,杏鮑菇皂苷的得率呈上升趨勢,在pH8.2處達到最大值后,在8.2～10.2呈下降趨勢。由于皂苷的分子結構可能有羥基,呈酸性,可與堿反應成鹽而溶于水,因此，當提取液呈堿性時有助于皂苷的析出。由結果可看出,杏鮑菇皂苷的最適pH是8.2左右。

圖5 提取液pH對杏鮑菇皂苷提取率的影響Fig.5 Effects of pH on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.3 杏鮑菇皂苷的提取工藝優化

2.3.1 響應面設計工藝 根據單因素實驗及確定的四因素三水平,利用軟件Design-Expert.8.05b(原版)進行Box-Benhnken設計,確定杏鮑菇皂苷的最佳提取工藝,設計及結果見表2。

表2 響應曲面法優化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

2.3.2 響應面分析 根據響應面設計得到的響應值結果進行分析,對實驗數據進行多次擬合回歸,以超聲提取時間(A)、液固比(B)、提取溫度(C)和提取液pH(D)為自變量,杏鮑菇皂苷得率(Y)為因變量建立二次回歸方程:

Y=-73.95+0.28A+2.90B+0.51C+9.50D-0.0008AB-0.00045AC+0.00075AD-0.0094BC+0.013BD+0.0093CD-0.0041A2-0.10B2-0.0034C2-0.61D2

中心組合方差分析見表3,由表3方差分析結果可以看出,此回歸模型p<0.0001,為極顯著,失擬項不顯著(p=0.084>0.05),即表明此模型的擬合度較好,誤差較小,因此可以使用該模型對杏鮑菇皂苷的提取進行分析與預測。回歸方程中,一次項B為極顯著(p<0.01),這說明響應面優化試驗中所選擇的液固比對杏鮑菇皂苷的得率均具有極顯著影響;交互項AC、AD、BC、BD和CD是不顯著(p>0.05);二次項B2、D2對得率Y的影響均為極顯著(p<0.01),A2、C2對得率Y的影響均為顯著(p<0.05)。

表3 回歸模型顯著性檢驗結果Table 3 Significance test for regression model

2.3.3 響應面優化分析圖 各因素對杏鮑菇皂苷得率的交互影響曲面圖及等高線圖見圖6～圖11。由圖6～圖11可知,因素B對杏鮑菇皂苷得率的影響顯著,固定其他因素在一定水平,發現杏鮑菇皂苷得率隨液料比的增加而增大,表現為等高線變化最為陡峭;提取液pH次之,表現為等高線較為平滑。提取溫度和超聲提取時間影響最小,表現為等高線平滑。

圖6 超聲提取時間與液料比交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.6 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and liquid-feed ratio

圖7 超聲提取時間與提取溫度交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.7 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and temperature

圖8 超聲提取時間與提取液pH交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.8 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and pH

圖9 液固比與提取溫度交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.9 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of liquid-feed ratio and temperature

圖10 液固比與提液pH交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.10 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of liquid-feed ratio and pH

圖11 提取溫度與提取液pH交互作用的響應曲面圖與等高線圖Fig.11 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of temperature and pH

由圖11可知,提取液pH與提取溫度對總皂苷得率影響較顯著。總皂苷得率隨料液pH的變化先快速上升后緩慢下降;隨提取溫度的變化呈先上升后下降的曲線關系。

2.4 提取工藝優化驗證試驗

根據響應方程回歸設計,得到最佳提取條件:超聲提取時間30.6 min，液固比11.5 mL·g-1，提取溫度64.7 ℃，提取液pH8.4，皂苷得率最大值為3.28%。

根據實際操作要求即超聲提取時間31 min,液固比11.5 mL·g-1,提取溫度65 ℃,提取液pH8.4，進行3組平行試驗,在最佳提取條件下分別測得三組杏鮑菇皂苷得率,取平均值得3.19%,與理論最大值3.28%極為接近,說明優化方案具有可行性。

3 結論

本試驗在單因素的基礎上,運用響應面設計優化原理,確定杏鮑菇皂苷最佳提取工藝條件為:超聲提取時間31 min,液固比11.5 mL·g-1,提取溫度65 ℃,提取液pH8.4,此時杏鮑菇皂苷得率為3.19%,且與預測值較為接近。以超聲提取時間(A)、液固比(B)、提取溫度(C)和提取液pH(D)為自變量,杏鮑菇皂苷得率(Y)為因變量建立二次回歸方程。說明了試驗可行性的同時,也為杏鮑菇皂苷的工業化制備提供了理論依據。