高等植物葉黃素合成代謝與調控機制

汪雨茜,李大婧,何偉偉,包怡紅,劉春泉,宋江峰,黃午陽

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京210014;3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇南京 210014)

葉黃素(lutein)是屬于類胡蘿卜素的天然色素,在高等植物中能大量合成,且在植物生理代謝中起關鍵作用。它是植物光系統(photosystem II,PS II)的重要組成部分,在光合作用中捕獲光能,調節植物生長和發育,也以生物信號分子參與植物與環境的相互作用[1]。類胡蘿卜素在動物體內的吸收、貯存與代謝過程對其疾病防治、生長發育等有重要意義,如在人體內,葉黃素是維生素A合成的重要前體,是人眼視網膜黃斑色素的主要成分,具吸收有害藍光、保護眼睛的功能[2]。研究表明,年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是導致中老年人視力衰退甚至失明的主因,適當的葉黃素可降低AMD的發生率[2],但動物自身不能合成類胡蘿卜素。

葉黃素在動植物體內有廣泛的生理功用,一直以來,有關葉黃素的生理功能,植物體內的合成途徑等內容的研究頗受重視。本文從影響因子、關鍵酶及基因水平綜述高等植物中葉黃素合成代謝和調控的研究進展,為葉黃素的應用提供參考依據。

1 葉黃素的合成途徑及關鍵酶

類胡蘿卜素廣泛存在于蔬菜和花果類植物中,其生物合成包括多步復雜的次生代謝反應過程,即類異戊二烯途徑,其中涉及多種生化反應的關鍵酶[1]。

1.1 合成途徑

類胡蘿卜素的合成途徑如圖1所示。

圖1 高等植物中葉黃素的合成途徑和關鍵酶的作用

類胡蘿卜素的合成首先由兩分子合成前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(genranylgeranyl diphosphate,GGPP)通過八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)縮合成八氫番茄紅素(phytoene),而GGPP是在質體中通過甲基赤蘚糖醇4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)途徑產生,由一分子二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)先后與三個戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)分子在GGPP合成酶(genranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)催化下產生[3]。八氫番茄紅素經八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)和ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)引入雙鍵,經中間產物ζ-胡蘿卜素最終轉化為番茄紅素(lycopene)[4]。

番茄紅素在番茄紅素β-環化酶(lycopeneβ-cyclase,β-LCY)和番茄紅素ε-環化酶(lycopene ε-cyclase,ε-LCY)的催化作用下,產生不同的環狀(β-環或ε-環)端區,將類胡蘿卜素路徑分為β和α兩個支路[5]:β分支中β-LCY可催化番茄紅素兩端形成β-環,經中間產物γ-胡蘿卜素產生β-胡蘿卜素,再經胡蘿卜素β環羥化酶(β-OHase)催化通過中間產物β-隱黃質(β-cryptoxanthin)最終轉化為玉米黃質(zeaxanthin);α支路先由ε-LCY催化番茄紅素的一個末端形成含δ-環的δ-胡蘿卜素,隨后經β-LCY催化另一端生成α-胡蘿卜素,α-胡蘿卜素先經胡蘿卜素ε環羥化酶(ε-OHase)催化生成α-隱黃質(α-cryptoxanthin),再經β-OHase催化形成葉黃素(lutein)[6]。

1.2 關鍵酶

1.2.1 PSY PSY催化兩個C20GGPP形成八氫番茄紅素,是類胡蘿卜素合成途徑中的第一個合成酶,它引導碳流向胡蘿卜素,是合成途徑中的關鍵酶和限速酶,它的活性及表達直接影響合成效率,是合成途徑的“主控”位點,尤其是在一些類胡蘿卜素含量較低的植物組織中(如柑橘愈傷組織[7]、甘藍型油菜[8]和擬南芥種子[9]),對物種色澤的形成起著決定性作用。研究表明,PSY在生物進化過程中發生復制現象,得到PSYI和PSYII兩類基因,在高等植物中只有PSYI[10],它又包含三種組織特異的亞基(PSY1～PSY3),大多植物中包含兩種或兩種以上的亞基型。Galpaz等[11]觀察到,在番茄中三種不同的PSYI基因全部表達,PSY1影響番茄非光合組織及果實中類胡蘿卜素含量,PSY2負責葉片中類胡蘿卜素的合成,而PSY3可能在根部的脅迫應答中發揮作用[12]。類似的,在小麥非生物脅迫期間,觀察到PSY3水平上調,這提示PSY3的功能與其內含子的缺失有相關性,使類胡蘿卜素作為植物生長發育和脅迫應答中發揮重要作用[13]。2017年黃建峰、李寧等人分別對不同植物PSY蛋白氨基酸序列進行比較分析,發現同一PSY基因型在不同植物中存在特異功能,可能由于PSY的二級結構中元件(α螺旋、無規則卷曲、延伸等[14-15])的比例和分布存在差異,但其具體結構對功能有何影響還有待探明。推測可根據不同PSY基因拷貝數的差異相關性,提出整個PSY基因家族的進化模型。

1.2.2 PDS和ZDS 光合植物類胡蘿卜素合成途徑中的去飽和反應,需要PDS和ZDS兩種去飽和酶共同參與來完成,PDS催化八氫番茄紅素轉化成ζ-胡蘿卜素,ZDS催化ζ-胡蘿卜素向番茄紅素轉化,它們都是重要的限速酶。而在非光合生物如真菌和細菌中,僅通過一種去飽和酶CrtI就可完成整個去飽和反應。這種情況表明,從細菌到植物的類胡蘿卜素合成過程中,番茄紅素生成全反式番茄紅素的去飽和步驟從單一酶催化演化成更復雜的多酶催化過程[16]。目前PDS和ZDS基因已通過cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術從番茄[17]、水仙花[18]等植物中分離和拷貝出來,兩者基因大小相似,氨基酸序列的同源性達33%～35%,且在吡啶二硫核苷酸氧化還原酶多肽中都存在一個特定切序列保守的結構域,其編碼蛋白與質體膜緊密結合,利于電子的傳遞[19-20]。

1.2.3β-LCY和ε-LCY 植物類胡蘿卜素合成途徑中存在番茄紅素β-LCY和番茄紅素ε-LCY兩種環化酶,它們的活性及其分子間的協同作用是導致葉黃素、β-胡蘿卜素、葉黃素循環及類胡蘿卜素總通量的主要決定因素。這兩種酶根據環己烷雙鍵位置的不同,有選擇性地在番茄紅素一端或兩端發生環化反應,分別產生單環或雙環類胡蘿卜素。這是植物體內類胡蘿卜素生物合成途徑的重要分支路口,可通過調節這兩種酶的活性來決定所產生α-胡蘿卜素與β-胡蘿卜素的比例[21]。兩種番茄紅素產生β-環和ε-環兩種區域,β-環是最常見的形式,存在大多數光合生物中,相比之下,ε-環的分布存在較大的局限性。Ling等[22]首次成功克隆了甘薯中ε-LCY基因,其cDNA序列長1805 bp,開放閱讀框架(open reading frame,ORF)長度1236 bp,編碼411個氨基酸,分子量47 kDa,等電點(PI)6.95。據報道,在不同植物中分離出的β-LCY氨基酸序列具有較高同一性,將已克隆出ε-LCY的基因信息與β-LCY序列比較同源性,結果達77%,發現ε-LCY可由β-LCY復刻產生[23]。

1.2.4β-OHase和ε-OHase 胡蘿卜素合成代謝中的環羥化酶包括β-OHase和ε-OHase兩種,它們以環狀類胡蘿卜素為底物合成葉黃素[24]。β-OHase和ε-OHase同屬細胞色素P450型單加氧酶類羥化酶,具有羥基化環狀類胡蘿卜素作用,但檢測到兩個基因的內含子和外顯子的數量及結構完全不同[25]。β-OHase催化植物中β-胡蘿卜素,經中間產物β-隱黃素合成玉米黃素的過程,β-OHase基因在植物中成對出現,已從煙草等多種植物中分離[26]。而ε-OHase是葉黃素合成中所需的羥化酶,在一些植物和藻類[27]中被檢測到,但對其研究甚少仍屬未知領域。

2 類胡蘿卜素合成的調控

植物的整個生命周期都在參與調節類胡蘿卜素的合成,類胡蘿卜素的組成與含量都與植物的發育要求及外部的環境條件相適應。此外,通路中還存在著一些關鍵調控點,可以控制代謝物進入的通路和通量[1],從而對代謝過程進行調控。

2.1 自身因素及外界因素

植物中類胡蘿卜素的合成受自身發育及許多外界因素的雙重作用和影響,激發或阻礙代謝中的生化反應,從而調控代謝途徑,影響合成和積累葉黃素或其他物質。

2.1.1 自身發育因子 植物體內類胡蘿卜素的合成并不是獨立轉化的過程,還涉及其自身發育因素和遺傳基因,它們從根本上決定了其代謝的途徑和能力。Moehs等[28]研究了萬壽菊遺傳基因突變導致的不同表型中(從白色到深橙色)類胡蘿卜素的差異,發現色澤表型主要由葉黃素的含量不同所致,淺色品種花瓣中葉黃素含量極低(≤100 μg/g FW),而黃色品種花瓣中含量較高(≥1500 μg/g FW),植物在不同生長階段中的發育因子也會調控葉黃素的合成。脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dexoy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是MEP途徑中的合成酶。Tritsch等[29]在研究番茄果實成熟過程中發現DXS基因的表達受到機體發育的控制,具有明顯的組織特異性,并與PSY協同表達,GGPS、PSY、PDS的mRNA表達水平提高了數十倍,導致番茄紅素大量積累,類胡蘿卜素總量上升。此外,在類胡蘿卜素的合成與果實成熟關系的研究中,Kato等[30]發現果實成熟過程中橘皮和汁囊中PSY、PDS、ZDS、β-LCY、β-OHase基因表達量同時增加,導致β-隱黃質和玉米黃質的大量合成。Cao等[31]在黃桃果實成熟期間類胡蘿卜素積累情況的研究中也表示,果實成熟期間玉米黃素和β-隱黃素含量隨著成熟度的增加逐漸升高,在果實完全成熟時其含量達到1.45和0.62 μg/g FW。以上結果提示在果實成熟期產生的某些激素(如脫落酸)[32]可能對類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶具有調控作用。

2.1.2 光信號 光信號是類胡蘿卜素合成代謝過程中主要的影響因子,不同的光照時間、光照強度及光質對類胡蘿卜素合成途徑有不同的影響機制,調控合成的流向和流量。Rau[33]首次研究指出,在被子類高等植物中,光照時間及光切入時間會影響類胡蘿卜素合成,尤其是在幼苗發育時期。早期研究假設被子植物中光誘導機制類似于細菌和真菌中誘導機制:避光種植的幼苗在短時間暴露于紅光后,在隨后的黑暗時期中類胡蘿卜素增加數倍。但不斷研究發現在白芥子、芥菜幼苗中表現出不同的機制[34]:只有在連續長時的光照下,經過滯后期后,類胡蘿卜素合成速率增加,一旦進入黑暗環境,合成速率便會下降。此外,第二次照射時不存在滯后期,合成速率立即增加。在光照前向植物體中添加蛋白質合成抑制劑,將完全阻斷類胡蘿卜素的合成,在光照后不同時間加入抑制劑后,抑制作用隨時間的增加而減小,可得出結論:光誘導是從頭誘導,是誘發合成途徑的第一步,從而推定光誘導決定特定生物體中整套類胡蘿卜素的合成能力,且是該合成途徑中的必要條件。此處強調光誘導過程僅建立了類胡蘿卜素合成的能力,但根據機體特征、條件變化等因素,類胡蘿卜素合成水平也存在較大差異,這些差異即反映出生物合成途徑中各個步驟改變光誘導合成類胡蘿卜素能力的結果。

光照強度對葉黃素循環有較大的影響,強光下促進玉米黃質和新黃質(neoxanthin)的生成,有助于光捕捉復合物(light harvesting complexs,LHCs)收集過剩的光能,保護植物組織免受光損傷[35]。以前認為類胡蘿卜素是光合生物中所必需的,然而目前研究結果表明,對于某些物種來說，類胡蘿卜素除了具有明顯顏色表征外并不是其生長發育的必需物質,但當其受到某些外界脅迫(如強光)時,類胡蘿卜素仍為這些生物提供了保護作用,同時也調節了類胡蘿卜素的組成和通量[36]。

不同的光質對類胡蘿卜素的合成也有影響。Karppinen等[37]研究表明,植物中光敏色素作用因子(phytochrome-interacting factors,PIFs)是光感受體,可通過特異性抑制PSY基因的表達來調節類胡蘿卜素的積累,而PIFs可感受并與紅光、遠紅光結合消除其抑制作用,促進類胡蘿卜素的合成[38]。植物光敏色素介導的光信號是調控植物中類胡蘿卜素合成的關鍵因素,但目前對于該信號通路的組成部分仍缺少相關理論知識的支撐,此外,光敏色素是否是植物中唯一的感光體還有待探明。早在1975年即有研究得出活性燃料亞甲基藍和甲苯胺藍可作為光誘導類胡蘿卜素合成中的人造光感受器,誘導類胡蘿卜素生成[39],而植物中是否可以加入可行性的人造感光體來誘導類胡蘿卜素生成仍需進一步研究。

2.1.3 抑制劑 研究發現一些化學除草劑(噠草伏、吡氟草胺、苯氧基丁酰胺等)是類胡蘿卜素生物合成中PDS的抑制劑,其與PDS結合,抑制其活性,導致八氫番茄紅素的大量積累、六氫番茄紅素紅素減少、類胡蘿卜素的積累受到抑制[40]。因而使用此類除草劑后,導致植物出現白化現象。而嘧啶衍生物是ZDS的抑制劑,將植物用嘧啶衍生物處理后,與之結合后使ZDS活性降低,下調ZDS的表達,使八氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素大量合成[41]。

2.2 基因工程

利用基因工程中各種手段來調整代謝通路中酶基因的表達,改變代謝的流向或阻斷某一競爭性代謝通路,改善類胡蘿卜素的組成,從而達到積累所需代謝產物的目的[42]。

2.2.1 基因突變 酶基因自身的突變,可以改變其在代謝通路中表達的程度,影響類胡蘿卜素積累。例如,PSY基因結構的變異主要表現為選擇性剪切及單核苷酸的多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)[43]。Howitt等[44]發現,在小麥胚乳中的PSY因選擇性剪切產生4種不同轉錄物,但只有野生型轉錄物可產生具酶活性的蛋白質,其mRNA豐度因其他剪接體而降低,導致有活性的PSY蛋白水平下降,改變類胡蘿卜素含量和小麥的顏色。木薯PSY2中一個單核苷酸的變異,能增強酶活性,提高β-胡蘿卜素含量[45]。質體醌作為PDS和ZDS去飽和反應的電子受體,在質體醌合成受阻的擬南芥突變體中,八氫番茄紅素大量積累并表現出白化表型[46]。類似的情況在水稻和玉米vp2突變體中也被發現[47]。在葉黃素合成中,酶基因的突變改變了羥基化和環氧化作用,可直觀地展示出葉黃素含量的變化。如lut1、lut2、ccr2、lut5等突變體都調節葉黃素的合成,CYP97A3羥化酶缺陷的擬南芥lut5-1突變體中引起α-胡蘿卜素積累,其水平相當于野生型中的β-胡蘿卜素[48],類似的具CYP97A3羥化酶缺陷的胡桃胡蘿卜中積累了高水平的α-胡蘿卜素,占總類胡蘿卜含量的10%[49]。植物類胡蘿卜素合成途徑中,酶基因自身的結構變異、轉錄因子的調控或基因間的相互作用成為其主要調控方式。

2.2.2 控制酶基因的表達 通過控制酶基因的表達,可以控制該酶所在代謝通路的產物積累,提高代謝產物含量。Dharmapuri等[50]用果實特異性PDS啟動子驅動β-LCY基因在番茄內進行過表達,明顯提升果實中β-胡蘿卜素、β-隱黃質和玉米黃質的水平,這是在番茄果實中葉黃素類代謝工程的第一個成功例子。Giorio等[51]在組成型啟動子的控制下用ε-LCY編碼基因轉化番茄紅甜菜品種,使果實中的δ-胡蘿卜素及葉黃素含量升高。Kim等[48]通過對單個羥化酶在葉片中的過表達分析,發現CYP97B3在類胡蘿卜素合成中促進了β-胡蘿卜素的合成,也證實了Yang等[52]在紅藻中所發現的PuCHY1(屬于CYP97B亞科)的活性,即當其在擬南芥chy2突變體中過表達時,葉黃素、紫黃質、新黃質等類胡蘿卜素大量積累。Liu等[53]將小球藻中PDS基因修飾后表達,使類胡蘿卜素總量提高32%。

此外,也可以阻斷或減弱一條或多條分支競爭性途徑,改變代謝流量,以提高目的產物所在分支的代謝速度及流量。Yu等[54]使用RNA干擾技術下調了歐洲油菜中ε-LCY的表達,增加β-胡蘿卜素、玉米黃質、紫黃質及葉黃素含量,抑制轉基因煙草和甘薯中ε-LCY的表達能夠提高β分支產物的合成,并可促使細胞防御鹽介導的氧化應激,增強植物對非生物脅迫的耐受力[55-56]。由此,施加相應的技術手段減弱類胡蘿卜素合成中某種酶基因的表達,使相關基因的轉錄顯著增加。

2.2.3 表觀遺傳機制 研究指出,表觀遺傳機制也參與調控類胡蘿卜素生物合成基因的表達,生物體通過DNA甲基化修飾影響轉錄因子的活性而調控代謝過程[57]。組氨酸甲基轉移酶(Set Domain Group 8,SDG8)對類胡蘿卜素組成的調節揭示了表觀遺傳機制對代謝通量編程及微調的重要作用,SDG8可改變類胡蘿卜素合成中酶原有的甲基化狀態,從而下調酶基因表達,降低類胡蘿卜素的含量[58]。Xu等[59]利用400 μmol/L的5azaC去甲基化處理含高水平類胡蘿卜素的柑橘,隨著處理濃度的升高,類胡蘿卜素發生降解,葉黃素、α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素含量分別降低了88%、79%和64%,在p<0.01水平上具顯著性,但未報道具體影響哪些酶而導致降解,仍有待研究。類似這樣染色質修飾控制類胡蘿卜素合成中酶基因的表達,也成為種類胡蘿卜素合成的一種調控機制。

3 展望

近年來,對高等植物中類胡蘿卜素的合成代謝及其調控等方面的研究已取得了明顯的進展,尤其是PSY、PDS、ZDS等關鍵酶基因,已在多種植物中鑒定并克隆出來,揭示了各種酶在其合成途經中的關鍵功用。因此,可利用植物基因工程技術調整類胡蘿卜素生物合成途徑中各關鍵酶的表達,提高類胡蘿卜素含量。目前,通過基因手段確定了某些植物中酶基因與代謝途徑中酶基因的同源性,但僅得知其基本催化功能,而各種酶所對應的底物或產物的特異性要求還未了解,這也許會影響整個代謝過程,建議對酶基因在代謝中的作用進行深入研究。合成途徑中各種酶的比例及活性大小對代謝通量的貢獻程度、合成類胡蘿卜素前體供應的調節機制和下游分支途徑中所需的酶基因的調控方式及影響因素也需研究探明。對于植物葉黃素合成途徑的調控,可運用組學方法來尋找并鑒定葉黃素類合成支路中關鍵酶的輔助因子或調節因子,探討酶與輔助因子間相互聯系及作用的原理,以及抑制其他支路的合成,有針對性地進行干預調控,提高外源基因在植物體內的特異性表達,控制代謝的節奏與方向。此外,還需探究外源基因的導入是否會對其他物質產生影響;同時加強實驗力度,將科學理論轉向實踐應用,更有效地促進葉黃素的合成與積累,發揮其生理作用。