榛子粕抗氧化肽的分離純化及序列分析

陳 艷,呂春茂,*,韓金晶,姬昱佳,付沁璇,劉 璐,徐嘉一

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110000;2.內蒙古鄂爾多斯市東勝區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局,內蒙古鄂爾多斯 017000)

在機體內,適當?shù)淖杂苫鹬匾纳飳W作用[1],然而機體內自由基和抗氧化物質失衡時,過量的自由基會對機體細胞和一些生物大分子進行攻擊[2],導致細胞死亡和組織氧化性損傷。大量研究證明,自由基引發(fā)的氧化應激反應與心血管疾病、癌癥、糖尿病等多種疾病密切相關[3-4]。適當?shù)难a充抗氧化劑能減少由自由基引發(fā)的機體氧化損傷和功能損傷。目前,人工合成的抗氧化劑丁基羥基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羥基茴香醚(Butylated hydroxyanisole,BHA)等被懷疑可能致癌[5-8],而天然抗氧化劑由于具有良好的抗氧化活性且安全性極高,越來越受到廣泛的關注[9-10]。

榛子營養(yǎng)價值豐富,種仁中含有15%～25%的蛋白質及8種必需氨基酸,具有抗氧化、增強肌體免疫力、消除疲勞等功效,是一種優(yōu)質蛋白資源。目前國內對榛子的研究主要集中在榛子蛋白質和抗氧化肽的提取工藝和體外抗氧化活性,而國外對榛子的研究集中在過敏源和烘焙方面,對榛子抗氧化肽的氨基酸序列研究較少。本實驗以平歐榛子粕為原料,利用中性蛋白酶提取榛子粕抗氧化肽,用超濾膜和葡聚糖凝膠分離純化榛子粕抗氧化肽,以DPPH自由基清除率為指標,并采用高壓液相串聯(lián)四級桿質譜(Liquid charomatography-mass spectrometry,LC-MS/MS)分析榛子粕抗氧化肽的氨基酸序列,以期為榛子的精深加工與綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛子粕 榛子粉過80目篩,乙醚脫脂;中性蛋白酶(6000 U/g) 北京Solarbio科學技術有限公司;DPPH(2-2聯(lián)苯基-1-苦基肼基) 美國Sigma-Aldrich公司;Millopore超濾膜 Millopore有限公司;葡聚糖凝膠G-10 鼎國昌盛生物技術有限公司;高效液相色譜淋洗劑乙腈 國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

VARIAN紫外可見分光光度計 美國瓦里安技術中國有限公司;日立L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立有限公司;Amicon超濾杯 Millipore有限公司;Shim-pack GIS C18(φ2.1×75 mm)色譜柱 日本島津公司;超高壓液相色譜串聯(lián)四級桿質譜LC-MS-8050 日本島津有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榛子粕蛋白的制備 堿溶酸析法:榛子粕溶于水,料液比為3.84 g/mL,用1% NaOH調節(jié)pH至8.5,在47 ℃超聲波中振蕩57 min,4000 r/min離心25 min,取上清液;冷卻至室溫,1% HCl調節(jié)pH至4.5,4000 r/min離心25 min,取其沉淀層,再將pH調至中性,獲得榛子粕蛋白,在-80 ℃冰箱冷凍12 h,-40 ℃冷凍干燥機抽真空干燥,后放密封袋保存。

1.2.2 榛子粕抗氧化肽的制備 將榛子粕蛋白粉溶于水,料液比為2.5 g/mL,90 ℃水浴10 min,冷卻至室溫,調節(jié)pH至7.0,加入蛋白酶(17000 U/g),43.7 ℃酶解1.7 h后,溶液90 ℃滅酶10 min,冷卻至室溫,調節(jié)pH至7.0,于4000 r/min離心25 min,取上清液,得到榛子粕抗氧化肽,在-80 ℃冰箱冷凍12 h,-40 ℃冷凍干燥機抽真空干燥,干燥后放密封袋保存。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定 DPPH自由基清除率的測定[11]:取2 mL榛子粕抗氧化肽放入試管中,加入2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液,混合均勻,反應25 min,10000 r/min離心分離10 min,取其上清液,517 nm處測混合液吸光度Ai;均勻混合2 mL蒸餾水水和無水乙醇2 mL,517 nm處測混合液的吸光度Aj,2 mL 0.04 g/L DPPH無水乙醇溶液和2 mL蒸餾水均勻混合為對照組,517 nm處測混合液吸光度記為A0。

式中:A0:對照組吸光值;Ai:樣品組吸光值;Aj:空白組吸光值。

1.2.4 榛子粕抗氧化肽的分離純化

1.2.4.1 超濾分離 將中性蛋白酶水解產物用濾紙抽濾除雜質,然后在壓力為0.2 MPa下進行分液截留。分別選用截留分子質量為5 kDa和1 kDa超濾膜對榛子粕抗氧化肽(Halnut meal antioxidant peptide,HMAP)進行分離,收集HMAP1(>5 kDa)、HMAP2(1～5 kDa)和HMAP3(<1 kDa)三個組分,在-80 ℃冰箱冷凍12 h,-40 ℃冷凍干燥機抽真空干燥,干燥后放密封袋保存。將三個組分的濃度配制為3 mg·mL-1,測定三個組分的DPPH自由基清除率。

1.2.4.2 葡聚糖凝膠純化 將Sephadex G-10葡聚糖裝成1.6 cm×80 cm的玻璃層析柱,然后用蒸餾水洗脫3個柱體積。上樣濃度為10 mg·mL-1,上樣量為5 mL,洗脫速度0.4 mL·min-1,每管收集3 mL,收集60管,225 nm下檢測吸光值,并收集各洗脫峰,冷凍干燥;將每個洗脫峰配成終濃度為1 mg·mL-1,測定各組分的DPPH自由基清除率。

1.2.5 氨基酸組成的測定 酸水解:準確稱取0.02 g榛子粕抗氧化肽于水解管中,加入10 mL 6 mol·L-1鹽酸,加入正辛醇1～2滴,抽真空充入高純度氮氣,在充氮氣狀態(tài)下封口,再將水解管置于105 ℃烘箱內水解24 h,取出冷卻。打開水解管,將水解液倒入50 mL容量瓶內用蒸餾水定容,用蒸餾水反復沖洗水解管,吸取2 mL于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,殘留物用2 mL無離子水溶解,再蒸干,反復進行四次,最后蒸干,用2.5 mL 0.02 mol·L-1鹽酸溶液溶解,混勻過濾,待用。

色譜條件:梯度洗脫,分離柱柱溫57 ℃,反應柱柱溫135 ℃,緩沖液流速0. 40 mL·min-1,茚三酮流速0. 35 mL·min-1,通道1:檢測波長570 nm,通道2:檢測波長440 nm,進樣量20 μL。

1.2.6 LC-MS/MS測定氨基酸結構 液相色譜條件:Shim-pack GIS C18(φ2.1 mm×75 mm)色譜柱,進樣量0.1 μL;柱溫 40 ℃;流速 0.2 mL·min-1;液相色譜分離流動相為0.1% 甲酸-水(A)和0.1%甲酸-乙腈(B),按B:0～8 min,20%～40%;8～13 min,40%～80%;13～18 min,80%～20%進行梯度洗脫。質譜條件:電噴霧電離,正離子,離子噴霧壓4 kV;干燥氣為氮氣,流速10 L/min,溫度350 ℃;CID氣壓為270 kPa;質譜掃描范圍為50～1000 Da。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 榛子粕抗氧化肽分離純化

2.1.1 超濾分離 采用截留分子量不同的超濾膜對榛子粕抗氧化肽進行分離,獲得三個組分,分別為HMAP3(MW<1 kDa)、HMAP2(5 kDa>MW>1 kDa)、HMAP1(MW>5 kDa)。各組分的DPPH自由基清除率如圖1所示,HMAP3、HMAP2、HMAP1組分(3 mg·mL-1)的DPPH自由基清除率分別為80.375%±1.265%、72.205%±1.275%、48.855%±1.025%,且差異顯著(p<0.05)。可見,小分子質量的HMAP3組分DPPH自由基清除率最高。

圖1 不同超濾組分的DPPH自由基清除率

2.1.2 葡聚糖凝膠純化 選用分離范圍小于700 Da的Sephadex G-10葡聚糖凝膠進一步分離純化HMAP3組分。HMAP3被分成四個主要組分,分別命名為P1、P2、P3、P4(圖2)。P2、P3和P1(1 mg·mL-1)的DPPH自由基清除率高,分別為55.80%±3.025%、54.25%±2.935%、48.115%±2.305%,且差異不顯著(p>0.05);P4的DPPH自由基清除率最低,為8.665%±0.385%(圖3)。本文以清除率相對較高的P2為研究對象,進一步深入研究。

圖2 葡聚糖凝膠Sephadex G-10分離純化HMAP3

圖3 葡聚糖凝膠分離純化HMAP3后各組分的DPPH自由基清除率

2.2 P2的結構表征

2.2.1 P2的氨基酸組成 本實驗主要以DPPH自由基清除率相對較高的P2為研究目標,分別測定榛子粕抗氧化肽和P2組分的氨基酸組成。由表2可知,榛子粕抗氧化肽的主要氨基酸分別為Glu、Arg、Asp、Ala、Leu,疏水性氨基酸占總氨基酸12.21%±0.850%。P2的主要氨基酸分別為Leu、Glu、Val、Tyr、ILe、Arg、Ala、Phe、Asp、Gly。榛子粕抗氧化肽純化后,氨基酸含量由(42.995±2.005) g/100 g增加到(48.777±0.252) g/100 g,有7種氨基酸含量明顯增加,其中包含6種疏水性氨基酸Ala、Val、ILe、Leu、Tyr、Phe,疏水性氨基酸占總氨基酸的56.55%±0.175%。

表2 榛子粕抗氧化肽和P2組分的氨基酸組成及含量

2.2.2 P2的氨基酸序列 利用超高壓液相色譜對P2組分進行梯度洗脫,共分有9個峰;然后對每個峰離子強度最高的母離子進行碰撞誘導解析形成二級質譜,進行二級質譜解析。

圖4 榛子粕抗氧肽P2的超高效液相色譜圖

所檢測到的9個峰信息見表3,峰1的一級質核比131.15,為單一的氨基酸,Lhor等和Elias等研究表明，單一的氨基酸抗氧化性明顯低于短肽的抗氧化性[12-13],故不用做二級質譜的母離子。峰8的一級質核比為814.45,與本實驗中Sephadex G-10的分離范圍不符,故也不作為二級質譜的母離子。峰2、3、4、5、6、7和9的質譜信息和氨基酸序列分別見表3和圖5。

表3 肽P2的離子峰信息

圖5 肽P2的質譜圖

3 結論與討論

本實驗采用超濾對榛子粕抗氧化肽初步分離,結果表明,相對分子質量小的肽比相對分子質量大的肽抗氧化能力更強,這與前人研究結果相一致[14-17]。相對分子質量小的肽更易參與自由基的氧化應激反應[18-19]。同時,利用Sephadex G-10葡聚糖凝膠將HMAP3分離成4個組分,其中,P2、P3和P1的DPPH自由基清除率高且差異不顯著(p>0.05)。本文以清除率相對較高的P2為研究對象,利用超高壓液相色譜—串聯(lián)質譜法測定了其抗氧化短肽的氨基酸序列。P2中共鑒定到7個榛子粕抗氧化肽,其氨基酸序列分別為His-ILe/Leu-Pro(362 Da)、ILe/Leu-Val-Asp-Glu(475 Da)、Thr-Pro-Pro-His-Lys(588 Da)、His-ILe/Leu-His-Ser-Ala-Thr(662 Da)Cys-His-Ser-ILe/Leu-Met-ILe/Leu(701 Da)、Thr-His-Ala(327 Da)、Phe-ILe/Leu(279 Da),含有大量的疏水性(ILe/Leu、Val、Ala、Pro)和芳香性氨基酸(Phe)。有報道表明,疏水性氨基酸和芳香性氨基酸可以提高短肽的抗氧化能力[1,20],Garcia等[21]從櫻桃中分離純化的抗氧化短肽含有大量的疏水性和芳香性氨基酸。Xing等[22]認為疏水氨基酸的疏水基團更易與疏水自由基反應,短肽中的疏水氨基酸ILe/Leu、Val、Ala和Met有較強的自由基清除能力。含有吡咯烷環(huán)的疏水性氨基酸Pro更易猝滅單線態(tài)氧,因此含有Pro的短肽抗氧化能力更強[23]。芳香性氨基酸Phe和His對肽抗氧化活性也起著重要作用,由于它們含有咪唑環(huán)提供質子,起到清除自由基的作用[5]。同時,榛子粕抗氧化短肽還富含His、Met、Cys、Ser、Thr等氨基酸殘基。Cys上-SH基團可以直接與自由基發(fā)生反應,提高這些氨基酸殘基的抗氧化能力[24]。有研究表明,含Met、Cys、His等氨基酸殘基的短肽抗氧化能力強[25],特別是含有為自由基提供質子的氨基酸Leu和Met肽抗氧化能力更強[26]。

本實驗中,純化后榛子粕抗氧化肽P2(1 mg·mL-1)的DPPH自由基清除率為55.805%±3.025%,后續(xù)實驗將對該榛子粕抗氧化肽進一步進行體內抗氧化活性研究,同時,也將對P1和P3組分開展進一步的研究,為深入開發(fā)利用榛子粕抗氧化肽提供理論依據(jù)。