海洋濕地環境中拮抗水產品腐敗菌的乳酸菌篩選與鑒定

孫夢桐,林 洋,白鳳翎,*,劉心雨,邢曉紅,馬歡歡,呂欣然,勵建榮,沈 琳

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

水產品富含優質蛋白、不飽和脂肪酸和多種微量元素,是人類不可或缺的營養要素來源[1]。腐敗菌是導致生鮮水產品腐敗的主要因素之一,水產品腐敗菌主要包括假單胞菌、希瓦氏菌和弧菌等。生物防腐技術具有安全、綠色、無損等優勢,已逐漸成為食品防腐保鮮技術的發展方向。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)通過生態位競爭、營養物競爭、形成酸性環境以及產生拮抗性代謝產物等方式抑制其他微生物的生長[2-3],從天然生態環境中分離的優良菌株已廣泛應用于乳制品、肉制品、水產品及發酵果蔬制品等的防腐保鮮[4-5],乳酸菌生物制劑具有良好的發展前景[6-9]。

乳酸菌生物菌株主要來源于傳統發酵食品、動物腸道、飼料及自然生態環境中[10-14]。海洋環境中如魚腸道、體表及水體環境也棲息著大量的拮抗性乳酸菌。Picchietti等[15]從鯛魚腸道微生物分離的果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)AS17B能顯著提高鯛幼蟲和魚苗的存活率。Rajaram等[16]從海洋環境的泥沙中分離的乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)02對枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、大腸桿菌和志賀氏菌都顯示出廣泛的抗菌活性。Hwanhlem等[17]在泰國南部紅樹林的土壤、水、葉、枝和果實中分離出對冷藏蝦中單增李斯特菌、熱死環絲菌有拮抗作用的乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.lactis)KT2W2L,該菌株可用于控制食品腐敗菌和致病菌。

比較而言,海洋濕地環境中拮抗性乳酸菌的研究相對較少,因該環境中乳酸菌具有耐鹽性特征,對控制海產品腐敗菌具有較好的應用價值。蘆葦和堿蓬草是渤海北岸普遍生長的耐鹽性植物,其根部也棲息著豐富微生物資源,目前國內對沿海植物乳酸菌資源開發的研究較少。本文從渤海錦州海岸濕地植物蘆葦和堿蓬草根部分離篩選拮抗性乳酸菌,對水產品中希瓦氏菌、假單胞菌和副溶血弧菌等進行拮抗作用研究,旨在獲得性能優良乳酸菌拮抗菌株用于生物制劑,對控制海產品腐敗菌和致病菌具有一定的理論和應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紅色堿蓬草須狀根、蘆葦白色須狀主根 采自錦州濱海新區渤海灣海岸濕地;腐敗希瓦氏菌(ShewanellaputrefaciensATCC 8071)、副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusATCC 33847)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 9027) 上海北諾生物科技有限公司;MRS瓊脂、LB肉湯、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限公司;胰蛋白酶(250000 U/g)、木瓜蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(200000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、胃蛋白酶(15000 U/g) 華藍化學有限公司;乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司;細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix 上海生工生物工程有限公司。

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 北京市東聯哈爾(北京)儀器制造有限公司;SPX-250智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;IKA Vortex GENIUS 3振蕩器 德國IKA公司;5804R冷凍高速離心機 德國艾本德股份有限公司;ABI stepone plus PCR儀 德國艾本德股份有限公司;Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠;V3型全自動菌落計數儀 杭州迅數科技有限公司;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;Labconco Free Zone 2.5臺式真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌分離 在無菌條件下,取堿蓬草須狀根和蘆葦白色主根根部各10.0 g于90.0 mL無菌生理鹽水三角瓶中,充分振蕩5 min后,用接種針挑取一環菌懸液在1.0% CaCO3的MRS固體培養基劃線接種,37 ℃培養48 h。挑取有溶鈣圈的白色菌落進一步分離純化,挑取單菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗[18]。

1.2.2 乳酸菌對腐敗菌和致病菌的拮抗實驗 將分離得到的乳酸菌菌株在MRS液體中活化3代得到菌懸液,4 ℃ 8000 r/min離心5 min后,0.45 μm濾器過濾得到無細胞上清液(cell free supernatant,CFS)和菌體細胞;S.putrefaciens在LB肉湯中30 ℃恒溫靜置培養12 h活化至3代,無菌條件下取1.0 mL菌液于9.0 mL 0.85% NaCl中獲得10倍稀釋液并進行梯度稀釋,取10-6、10-7稀釋液1.0 mL于平板中(每稀釋度3個平行),倒入20～25 mL(45±1) ℃滅菌LB固體培養基,搖勻在30 ℃下培養48 h后，進行菌落計數,得到菌液107CFU/mL,4 ℃條件下保存。稀釋10倍得106CFU/mLS.putrefaciens菌懸液為指示菌,利用牛津杯打孔法進行拮抗性實驗。將10.0 mL素瓊脂倒入無菌平板中,將牛津杯放在凝固后素瓊脂表面。吸取125 μL 106CFU/mL菌懸液置于25 mL，(45±1) ℃ LB固體培養基,搖勻,倒入置有牛津杯的平板中(不要倒進牛津杯的孔里)。凝固后取出牛津杯,分別在牛津杯孔中加入180 μL的菌懸液、CFS和菌體細胞,37 ℃培養24 h后用V3型全自動菌落計數儀記錄抑菌圈直徑,參照文獻[19]每個菌株設3個平行實驗。V.parahaemolyticus、P.aeruginosa的測定方法同上。

1.2.3 乳酸菌生長與拮抗活性曲線 在15.0 mL MRS液體培養基中接種0.3 mL乳酸菌培養液,37 ℃恒溫培養40 h,每隔4 h分別測定菌株細胞生長量OD600值和pH,并按照1.2.2測定菌株CFS對S.putrefaciens的抑菌圈直徑,以時間為橫坐標繪制乳酸菌拮抗活性生長曲線。

1.2.4 乳酸菌抗菌性能研究

1.2.4.1 酶對乳酸菌抑菌活性的影響 將乳酸菌CFS調至各蛋白酶最適pH后,加入木瓜蛋白酶(pH7.0)、胃蛋白酶(pH2.0)、胰蛋白酶(pH7.5)、中性蛋白酶(pH7.0)和堿性蛋白酶(pH10.0),使其終濃度為1.0 mg/mL,37 ℃水浴2 h,按1.2.2測定其對S.putrefaciens的抑菌活性,計算乳酸菌CFS的抑菌活性喪失率。

式中:φ(對照)為對照組乳酸菌CFS對S.putrefaciens的抑菌圈直徑(mm);φ(酶處理)為酶處理后乳酸菌CFS對S.putrefaciens的抑菌圈直徑(mm)。

1.2.4.2 溫度對乳酸菌抑菌活性的影響 乳酸菌CFS分別在40、60、80、100、121 ℃下處理30 min后,按1.2.2方法測定抑菌活性。

1.2.4.3 pH對乳酸菌抑菌活性的影響 用1.0 mol/L的HCl溶液和1.0 mol/L的NaOH溶液調節菌株CFS pH分別為pH3.0、3.5、4.0、4.5和5.0,按1.2.2測定抑菌活性。

1.2.4.4 NaCl濃度對乳酸菌抑菌活性的影響 將100 μL乳酸菌菌懸液分別加入5.0 mL含有0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0% NaCl的MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h。按1.2.2測抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌菌株鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定 參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》將篩選出的乳酸菌菌株在37 ℃MRS液體培養基中培養24 h,用接菌環接入各個細菌微量生化反應管中,37 ℃培養24 h,記錄反應管顏色變化,并參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行鑒定[20-21]。

1.2.5.2 16S rRNA鑒定 將所選乳酸菌培養至對數生長期，用DNA快速抽提試劑盒提取其DNA。正向引物為27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′),反向引物為1492r(5′-TACGGYTACC TTTGTTACGACTT-3′)[22]。PCR 擴增反應體系(25μL):上游引物、下游引物各加入1.0 μL,DNA模板加1.0 μL,取Taq PCR Master mix12.5 μL,超純水加9.5 μL。PCR擴增:94 ℃條件下預變性2 min,94 ℃條件下變性1 min,60 ℃條件下退火1 min,72 ℃條件下延伸 90 s后循環30次,4 ℃下保溫。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。登陸GenBank并對測得序列進行BLAST同源性比較,應用MEGA5.0構建系統發育進化樹。

1.3 數據處理

實驗數據分析處理采用Origin 8.0進行,結果用平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌菌株分離結果

從蘆葦根和堿蓬草根中共分離獲得98個典型乳酸菌菌落,經革蘭氏染色(陽性)和過氧化氫酶實驗(陰性)初步鑒定出23株乳酸菌,純化后按乳酸菌來源和挑取順序進行命名。

2.2 乳酸菌對水產品腐敗菌和致病菌拮抗結果

采用牛津杯打孔法從23株乳酸菌中篩選出6株對S.putrefaciens、V.parahaemolyticus、P.aeruginosa有拮抗作用的菌株,其中2株LW-4、LW-7來自蘆葦根,4株JP-3、JP-8、JP-11、JP-12來自堿蓬草根。圖1為菌株LW-4、LW-7、JP-3、JP-8、JP-11、JP-12的CFS抑制S.putrefaciens和P.aeruginosa的結果,可以看出牛津杯孔周圍均出現明顯抑菌圈,說明6株乳酸菌對菌株S.putrefaciens和P.aeruginosa均有一定的拮抗作用。

圖1 乳酸菌CFS對S. putrefaciens和P. aeruginosa拮抗作用

表1為6株乳酸菌菌懸液和CFS對S.putrefaciens、V.parahaemolyticus、P.aeruginosa拮抗作用結果,從表中可看出,對3株指示菌拮抗作用相對較強的是來自堿蓬草根的菌株JP-12,菌懸液抑菌圈直徑分別為19.04、16.09、17.18 mm,CFS抑菌圈直徑為18.63、15.54、16.97 mm。菌懸液與菌體細胞、CFS與菌體細胞的抑菌結果有顯著性差異(p<0.05),說明菌株抑菌活性物質主要存在于CFS中。因此,選取菌株JP-12進行后續抑菌活性研究。

表1 乳酸菌菌懸液和CFS對三種腐敗菌抑菌作用

2.3 乳酸菌生長與拮抗活性曲線

圖2是菌株JP-12對S.putrefaciens的拮抗活性和pH變化曲線,從圖中可以看出,菌株JP-12對S.putrefaciens的拮抗活性與菌體生長呈現同步增長,pH則呈現逐步下降趨勢,24 h后維持在pH3.5左右。到28 h時,菌株JP-12的CFS對S.putrefaciens的抑菌活性達到峰值,抑菌直徑為18.90 mm,說明菌株JP-12在此時的抑菌作用最強。因此選擇28 h菌株JP-12 CFS作為后續拮抗性實驗研究。

2.4 乳酸菌拮抗活性的影響因素的分析

2.4.1 蛋白酶對拮抗活性的影響 表2是各種蛋白酶對S.putrefaciens的抑菌結果,從中可以看出經蛋白酶處理后菌株JP-12 CFS抑菌直徑與對照組抑菌直徑差異顯著(p<0.05)。

表2 蛋白酶對菌株JP-12 CFS拮抗活性影響

從抑菌活性喪失率來看,經胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后,CFS抑菌能力均有下降,對各種蛋白酶的抑菌活性喪失率在19.07%至24.21%之間。其中胃蛋白酶處理后抑菌直徑為15.62±0.33 mm,活性喪失率為24.21%;堿性蛋白酶為16.68±0.35 mm,抑菌活性喪失率為19.07%,雖然兩者之間有差異性顯著(p<0.05),但五種酶對菌株JP-12拮抗活性的影響差異性不大。由此說明,菌株JP-12 CFS中抑菌活性物質具有蛋白質特性,酶處理只使其喪失部分活性,這與Ponce和Taheur等[23-24]的研究結果相似。

2.4.2 溫度對拮抗活性的影響 經不同溫度處理后菌株JP-12 CFS對S.putrefaciens的拮抗作用結果如圖3所示,從中可以看出,不同溫度處理的CFS，其抑菌直徑與對照組無顯著差異(p>0.05),表明溫度對拮抗活性影響不大,抑菌活性物質具有熱穩定性。Hwanhlem等[25]對分離自雞腸道中產細菌素乳酸菌CFS進行熱穩定研究,結果顯示抑菌物質具有良好的熱穩定性,本研究結果與其相似。

圖3 溫度對菌株JP-12 CFS拮抗S. putrefaciens的影響

2.4.3 pH對拮抗活性的影響 表3是不同pH下菌株JP-12 CFS對3株目標菌的拮抗作用結果,可以看出隨著pH的上升,菌株JP-12 CFS對目標菌的抑菌活性均逐漸下降,pH3.0～3.5時,菌株JP-12 CFS抑菌直徑與對照組無顯著差異;當pH5.0時,對3株目標菌的抑菌活性基本喪失。由此可以說明CFS中抑菌活性物質在低pH下活性較強,這與Argyri等[26]從發酵橄欖中篩選的乳酸菌菌株Lb.pentosusB282,Lb.plantarumB281和Lb.paracaseisubsp.paracaseiE93在不同pH下對Listeriamonocytogenes,Salmonellaenteritidis及EscherichiacoliO157∶H7的抑菌作用結果相似。

表3 pH對菌株JP-12 CFS抑菌作用的影響

2.4.4 NaCl濃度對拮抗活性的影響 圖4是菌株JP-12在0.5%～4.0% NaCl條件下對S.putrefaciens的抑菌結果,從圖中可以看出,在0.5%～3.0% NaCl范圍內，菌株JP-12對S.putrefaciens的抑菌直徑從16.56 mm上升到18.46 mm,表明其抑菌活性逐漸增加;當濃度增加至3.0%～3.5%時,菌株JP-12抑菌直徑分別達到18.46 mm和18.15 mm,表明在此范圍內菌株JP-12抑菌活性相對較高;當濃度為4.0%時,抑菌直徑為17.04 mm,呈下降趨勢,與3.5% NaCl具有顯著性差異(p<0.05)。由此可見,菌株JP-12在3.0%～3.5% NaCl具有較強的抑菌活性。

圖4 NaCl濃度對菌株JP-12抑菌活性影響

2.5 乳酸菌菌株的鑒定

2.5.1 生理生化鑒定 對菌株JP-12進行各種糖代謝實驗,結果見表4。依據實驗結果對照文獻[21]初步判定菌株JP-12為乳桿菌屬植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

表4 菌株JP-12的糖代謝實驗

2.5.2 16S rRNA鑒定 圖5為菌株JP-12的16S rRNA基因電泳圖,可看出1500 bp左右出現特異性亮帶,說明目標片段擴增成功。擴增產物送至生物工程(上海)股份有限公司進行測序后,獲得菌株JP-12的核苷酸序列,測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對,構建系統發育樹見圖6。從中可以看出,菌株JP-12與AB761309.1(Lactobacillusplantarum)在同一個分支上,置信度為98%。因此,鑒定菌株JP-12為植物乳桿菌,此鑒定結果與生理生化鑒定結果相一致。

圖6 菌株JP-12的16S rRNA基因系統發育樹

圖5 菌株JP-12的16S rRNA基因擴增電泳圖

3 結論

本文從錦州渤海灣海洋濕地堿蓬草根部分離獲得1株對腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌和副溶血弧菌具有較強拮抗活性的乳酸菌菌株JP-12。經生理生化和16S rRNA鑒定菌株JP-12為植物乳桿菌。經分析得出菌株JP-12發酵液在3.0%～3.5% NaCl時抑菌活性較強,表明對海洋水體環境有良好的適應性。依據菌株CFS的蛋白酶、溫度、pH等實驗結果，可初步判斷其抑菌活性物質具有蛋白質特性,并具有良好的熱穩定性,且在酸性條件下仍能夠保持穩定。研究結果表明，海洋濕地環境也是拮抗性乳酸菌的重要來源,該類拮抗性乳酸菌資源的開發對海產品防腐保鮮具有潛在的應用價值。