離體篩選彩葉鳳梨耐羥脯氨酸變異體的研究

崔克強，王彥尊，史華平，王計平

（1.山西省農業科學院果樹研究所，山西 太谷 030800；2.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801）

彩葉鳳梨（Neoregelia caroline）原產于南美熱帶地區，花期長達3個月，可在室內常年種植，是近年來非常流行的室內盆花之一[1]，適宜在疏松、肥沃的土壤中生長，但耐寒性較差。隨著組織培養技術在農業上的廣泛應用，目前利用化學誘變技術與離體培養相結合篩選抗性突變體的研究越來越受到人們的重視，已在茄子[2]、紫花苜蓿[3]、小麥[4]、草莓[5]、獼猴桃[6]、楊樹[7]等植物中篩選到抗性突變體。

烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）是常用化學誘變劑中效率高且負面影響較小的誘變劑，能夠引起單一堿基對發生改變而形成點突變，應用廣泛，突變體表現出的性狀多為顯性性狀，易于篩選，可以為種質創新、新品種培育及功能基因組研究分析提供大量基礎材料[8-11]，而且大量研究表明，在化學誘變過程中，以羥脯氨酸作為選擇壓力進行定向篩選，以提高植物體內脯氨酸含量，可以獲得抗性較強的突變體材料[3，12]。

本試驗利用組織培養技術對彩葉鳳梨單株試管苗進行EMS誘變及抗羥脯氨酸（L-HYP）篩選，進而定向篩選獲得抗寒性強的彩葉鳳梨變異體，為彩葉鳳梨的抗性育種提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以株高2 cm左右、長勢大致相同的彩葉鳳梨單株試管苗為材料，進行EMS誘變處理及抗寒突變體的篩選及鑒定。

試驗所用繼代培養基為MS＋KT4.0 mg/L＋IAA 0.5 mg/L，添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，調節pH值為5.8～6.0；試驗所需光照強度為2 000～3 000 lx，光照時間為14 h/d，培養溫度均為（25±2）℃。

1.2 試驗方法

試驗于2015—2016年在山西農業大學農學院植物組織培養實驗室進行。用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液配制不同體積分數EMS溶液，過濾滅菌，EMS溶液體積分數分別為0.1%，0.3%，0.5%，0.75%，1.0%，以不含EMS的磷酸緩沖液處理為對照。取預培養30 d的單株試管苗，用不同體積分數EMS 溶液分別浸泡 4，6，10，24 h 后，硫代硫酸鈉沖洗若干次，再用無菌水沖洗后，接種于繼代培養基中恢復生長、促進分化。存活率＝（存活試管苗數/處理試管苗總數）×100%；分化率＝（分化不定芽的試管苗數/處理試管苗總數）×100%。

將半致死劑量存活的試管苗進行繼代培養，經5，6，7 mmol/L的羥脯氨酸（HYP）逐級篩選后進行4℃低溫脅迫處理4 h，分別測定葉片的電導率、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性等生理生化指標，以正常繼代培養的試管苗作為對照，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 EMS誘變處理對彩葉鳳梨試管苗存活率的影響

表1 EMS誘變處理對彩葉鳳梨試管苗存活率的影響

由表1可知，不同體積分數EMS處理相同時間，隨著處理體積分數的增加，試管苗的存活率逐漸降低；而相同體積分數EMS處理時，隨著處理時間的延長，試管苗的存活率也逐漸降低。將預培養30 d的試管苗用EMS處理6 h，處理體積分數為0.1%～1.0%時的存活率分別為 60.0%，53.3%，48.4%，41.9%，12.9%，存活植株較多；EMS體積分數為1.0%時，單株存活率明顯下降；在EMS體積分數為0.5%，處理時間為6 h時，試管苗存活率為48.4%，可以作為半致死劑量，為了避免高體積分數EMS處理對試管苗造成太大的傷害，繼而導致試管苗生長受到抑制，EMS使用濃度以不超過0.75%為佳，故選用0.5%EMS處理彩葉鳳梨試管苗。

2.2 EMS誘變處理對彩葉鳳梨試管苗分化的影響

將預培養30 d的試管苗經EMS誘變處理后接種在繼代培養基上，以未經誘變處理的試管苗作為對照。從表2可以看出，彩葉鳳梨試管苗的平均分化率隨著EMS使用體積分數及作用時間的增加呈下降趨勢。在EMS體積分數為0.5%，處理時間6 h時，試管苗的不定芽分化率為36.9%。

表2 EMS誘變處理對彩葉鳳梨試管苗分化的影響

2.3 突變體篩選

由表3可知，0.5%EMS誘變處理6 h后的試管苗繼代培養30 d，經不同體積分數羥脯氨酸（HYP）逐級篩選后，發現對照組的不定芽在5 mmol/L的HYP處理下仍然有62.5%的試管苗存活，當處理濃度為6，7 mmol/L時，不定芽存活率均小于50%；將7 mmol/L處理下存活的植株繼續在相同濃度HYP處理下繼代培養，發現試管苗全部死亡；而處理組試管苗在不同濃度HYP篩選時存活植株數基本都超過50%，當7 mmol/LHYP處理時，試管苗存活率為46.1%，接近于50%，故選擇濃度7 mmol/L為耐HYP突變體的半致死劑量（表3）。將7 mmol/L濃度HYP處理下存活的試管苗接種到含有相同濃度HYP的培養基中培養30 d，仍然有10株存活，將存活下來的試管苗進行連續繼代培養3次，用于進行突變體的鑒定。

表3 HYP篩選對試管苗存活率的影響

2.4 突變體鑒定

2.4.1 EMS誘變及HYP篩選對繼代苗葉片電導率的影響 通過測定彩葉鳳梨突變體植株的電導率（以正常生長的彩葉鳳梨試管苗為對照），研究在4℃低溫脅迫下植株細胞膜受傷害程度。由表4可知，在4℃低溫脅迫后電導率會增加，相比對照組，經過HYP篩選存活下來的試管苗，電導率增加幅度較小，說明誘變株細胞膜受傷害程度較小，初步證明其具有較強的抗寒能力。

表4 低溫脅迫對葉片電導率的影響 %

2.4.2 EMS誘變及HYP篩選對繼代苗保護酶活性的影響 由表5可知，經過EMS誘變與HYP篩選的試管苗，在受到低溫脅迫后，植株體內產生的SOD含量是對照植株的1.5倍，POD則是對照植株的1.34倍，表明通過EMS誘變處理及HYP篩選能夠提高彩葉鳳梨試管苗SOD，POD的活性，這進一步說明經過EMS誘變處理后，彩葉鳳梨試管苗抗寒能力有所提高。

表5 低溫脅迫對保護酶活性的影響

3 結論與討論

EMS化學誘變產生點突變的頻率較高，染色體畸變較少，可以對植物的某種特殊性狀進行改良，是目前應用最廣泛、效果最好的一種化學誘變劑[13]。但EMS在誘變的同時會造成生理損傷，一定范圍內，隨著處理濃度和處理時間的提高，突變效率增加，生理損傷同時也會增大，所以，合適的濃度范圍是誘變成功的關鍵，一般使用半致死劑量作為最佳處理濃度[8]。本研究選用0.5%的EMS處理6 h時，存活率為48.4%，接近50%，且處理后試管苗的分化率為36.9%，是比較合適的誘變組合。EMS誘變對象多為種子[14-15]，但近年來，隨著組織培養技術的應用，利用誘變與組織培養相結合的方式創造新種質的研究已經獲得了很大的成功[4-6]。本研究采用彩葉鳳梨試管苗進行EMS誘變處理，獲得了抗寒突變體。

羥脯氨酸是脯氨酸的類似物，在誘導突變體時，采用在培養基中添加羥脯氨酸的間接篩選法，可以獲得抗性較強的突變體植株。曹必好等[16]用60Coγ-射線誘變與高濃度羥脯氨酸離體選擇相結合的方法，獲得了甘藍抗性變異體再生植株；李紅等[3]利用組織培養技術對紫花苜蓿愈傷組織進行疊氮化鈉（NaN3）誘變及抗羥脯氨酸（L-HYP）篩選，獲得抗性強的紫花苜蓿愈傷組織。本研究采用7 mmol/LHYP篩選突變體，獲得了彩葉鳳梨抗羥脯氨酸的試管苗，并再生培養成抗性植株。

植物在受到逆境脅迫后，體內活性氧的產生與消除的動態平衡遭到破壞，活性氧含量增加，加劇了膜脂過氧化作用，從而破壞細胞膜結構，SOD可以清除細胞內超氧陰離子，使其轉變為H2O2；POD則可以將轉變為O2，清除活性氧對細胞的毒害作用，保護植株抵抗逆境脅迫。本研究對篩選獲得的突變體植株進行4℃低溫脅迫處理，結果表明，突變體植株的電導率明顯低于對照，SOD，POD活性顯著高于對照，說明通過EMS誘變及HYP篩選獲得了誘變植株，且其抗寒能力顯著提高。