大白菜轉基因選擇劑卡那霉素的濃度篩選

齊仙惠，李梅蘭，巫東堂，李改珍，趙軍良

（1.山西省農業科學院蔬菜研究所，山西 太原 030031；2.山西農業大學園藝學院，山西 太谷 030801）

大白菜（Brassica rapa subsp.pekinensis）屬十字花科蕓薹屬植物，又稱結球白菜、包心白菜、黃芽白、膠菜等，是一種原產于我國的蔬菜。其具有抗寒、適應性強、味甘等特點，營養價值很高。因此，大白菜的栽培和育種研究越來越受到人們的關注[1]。近年來，植物遺傳轉化已成為應用生物學研究的熱門課題，為蔬菜品種的改良開辟了一條新途徑。目前，植物遺傳轉化中常用的2類選擇劑分別是除草劑類和抗生素類。其中，抗生素類的卡那霉素（Kan）是植物轉基因研究中最常用的篩選標記[2-3]，已被成功應用于黃瓜[4]、煙草[5]、水稻[6]、棉花[7-8]、花生[9]、菊花[10]等植物。由于不同物種和基因型以及外植體材料對Kan濃度的敏感性存在較大差異[11]，所以，需要針對具體的研究材料進行Kan最佳篩選濃度的確定。

本試驗擬研究不同濃度Kan對7#和9#大白菜幼苗生長發育的影響，通過比較2個品系在不同處理條件下的種子發芽率、子葉黃化率、下胚軸長度和幼苗鮮質量等，以篩選出2個大白菜品系的最佳選擇濃度，旨在為今后篩選轉基因大白菜植株奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

供試大白菜品系為7#和9#自交系。試驗試劑有卡那霉素（上海生工公司）、氯化汞、吐溫（Tween-20，美國BBI公司）、乙醇。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制 試驗采用MS基本培養基，以30 g/L蔗糖為碳源，添加6.5 g/L的瓊脂粉，調節pH值至5.8，用滅菌鍋在121℃下滅菌20 min。滅菌后待培養基冷卻至50℃左右時添加Kan，使培養基中 Kan 的終質量濃度分別為 0，100，150，175，200，225，250 mg/L。

1.2.2 種子消毒 取7#和9#大白菜種子，分別用無菌水沖洗干凈后，在無水乙醇中浸泡1 min，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min，其中加一滴Tween-20，最后用無菌水沖洗5次。消毒后分別播種于含有不同濃度Kan的MS培養基上，每個處理50粒種子，重復3次。

1.2.3 培養條件和植株生長狀態調查 將培養基置于培養溫度為（25±1）℃、光照強度為1 500～2 500 lx，光/暗為16 h/8 h的培養室中，待種子萌發后統計各處理的發芽率并觀察幼苗長勢；培養7 d后統計各處理幼苗的子葉黃化率、下胚軸長、主根長、側根數以及幼苗鮮質量。下胚軸的長度為下胚軸基部至芽頂端的長度，主根的長度為下胚軸基部至主根尖端的長度，側根數為根長大于1 cm的第1側根數。

1.3 數據統計與分析

采用SAS軟件對生長于不同Kan濃度下的2個大白菜幼苗的種子發芽率、子葉黃化率、下胚軸長、主根長、側根數以及幼苗鮮質量進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度Kan對種子發芽率及子葉黃化率的影響

將7#和9#大白菜種子接種到含Kan的培養基中，培養3 d后，種子陸續發芽。由統計結果可知（表1），除個別種子外，2個品種中幾乎所有的種子都能正常萌發，說明Kan的不同濃度對大白菜種子的萌發基本沒有影響。

表1 不同質量濃度Kan對7#和9#種子發芽率和子葉黃化率的影響 %

培養7 d后，在不含Kan的培養基中，7#和9#的幼苗生長健壯，沒有出現子葉黃化現象。在添加了Kan的培養基中，隨著Kan質量濃度的增加，子葉黃化率明顯增加，并有部分幼苗因黃化嚴重而死亡（圖1）；當Kan質量濃度為175 mg/L時，7#和9#大白菜的黃化率分別為91.89%和83.72%；當質量濃度為225 mg/L時，二者的子葉黃化嚴重，黃化率分別為100%和97.22%；當質量濃度為250 mg/L時，二者的黃化率均高達100%（表1）。

2.2 不同質量濃度Kan對幼苗生長的影響

幼苗在不含Kan的培養基中培養7 d后，植株生長健壯，子葉充分展開，大而濃綠，下胚軸正常生長，根系發達，側根較多（圖2）。其中，7#和9#的下胚軸長分別為3.13，1.76 cm，主根長分別為8.73，8.90 cm，分別具有 7.30，5.57條側根（表 2，3）。

在添加Kan的培養基中，2個品種的子葉伸展不充分，小而發黃，植株矮化嚴重，下胚軸和主根明顯短縮，根系不發達，沒有側根（圖2）。隨著Kan質量濃度的增加，7#和9#幼苗的下胚軸長和主根長、鮮質量均呈下降趨勢，且顯著小于對照植株 （表2，3）。

表2 不同質量濃度Kan對7#大白菜幼苗生長的影響

表3 不同質量濃度Kan對9#大白菜幼苗生長的影響

2.3 最佳Kan篩選濃度的確定

利用Kan作為選擇劑，一般要求其既能有效抑制非轉化細胞的生長，使之緩慢死亡，又不影響轉化細胞的正常生長[12]。本試驗中，100～250 mg/L的Kan均能有效抑制7#和9#大白菜幼苗的生長。其中，7#大白菜，在100 mg/L的Kan質量濃度下，子葉黃化率偏低（78.39%）；在200 mg/L的質量濃度下則偏高（97.33%）；在150，175mg/L的質量濃度下，子葉黃化率差異不顯著，均在90%左右，因此認為，7#大白菜的最佳篩選質量濃度為150～175 mg/L。大白菜9#，在175 mg/L的Kan質量濃度下，子葉黃化率偏低（83.72%）；在225 mg/L的質量濃度下則偏高（97.22%），因此認為，9#大白菜的最佳篩選質量濃度為200 mg/L。

3 討論

張麗華等[13]對4個加工番茄品種的Kan抗性進行了篩選，結果顯示，不同部位對Kan的敏感度不同：幼苗對Kan比子葉外植體敏感，而子葉外植體又比下胚軸外植體敏感。在本試驗中，Kan對根長、下胚軸和植株鮮質量的增加均有負面影響，且對根長的影響比對下胚軸和鮮質量的影響大，可能是由于植株的不同部位對Kan的敏感性不同，也可能與根系直接生長在培養基中有關[14]。而2個品系大白菜種子的萌發并未受到Kan的影響，各濃度處理下的種子均表現出與對照組基本一致的發芽率，這可能是由于有種皮的保護導致其對Kan的敏感性較差，以及其只接觸培養基表面的原因。

Kan已被廣泛應用于遺傳轉化的選擇上，利用合適濃度的Kan進行轉化植株的篩選非常關鍵。篩選濃度太高，會影響轉化種子發育為正常植株，篩選濃度太低又會有太多的逃逸體，從而加大后期鑒定工作的強度。不同物種和基因型對Kan濃度的敏感性有差異。張甲佳等[9]對4個花生品種的Kan敏感性進行了研究，結果表明，不同品種的花生胚小葉對Kan的敏感性差異較大，其中，D16的Kan敏感性最高，臨界質量濃度為100 mg/L；其次是J11和魯花11，臨界質量濃度均為150 mg/L；而花育22的敏感性最低，臨界質量濃度達到200 mg/L。張靜等[15]研究也認為，Kan對蘿卜種子萌發及生長發育有明顯的抑制作用，隨著Kan濃度的升高，致死率升高，主根和下胚軸長度變短。且不同品種對Kan的敏感性不同，在經Kan溶液浸泡后播種時，07Lb36-9和07Lb39的Kan致死濃度分別為150，300 mg/L。本試驗中，7#和9#大白菜對Kan的敏感性也有所不同，其中，7#比9#敏感性高，故其所需的最適篩選濃度較低。但在大白菜遺傳轉化試驗中，不同品種的抗性濃度仍需進一步研究。

4 結論

本試驗利用不同濃度的Kan對7#和9#大白菜進行處理，觀察子葉期幼苗生長情況并進行數據統計分析，研究結果顯示，隨著Kan濃度的增加，大白菜種子的萌發沒有受到影響，但子葉的黃化率隨之增加，下胚軸和主根的長度變短，鮮質量減輕，側根數減少。此外，不同大白菜品系對Kan的敏感程度不同，7#大白菜的Kan最佳篩選質量濃度為150～175 mg/L，9#大白菜則為200 mg/L。這些結果可為其他大白菜品種的抗性濃度篩選提供參考。