溫度對小球藻和銅綠微囊藻生長及葉綠素熒光特性的影響

馬 欠，鄧春暖，郭鋒鋒

(云南師范大學 a.旅游與地理科學學院，b.云南省高原湖泊生態與全球變化重點實驗室,昆明 650500)

研究水體藻類外界環境的變化對如何避免或減輕有害“水華”的發生具有重要的指導意義。溫度是決定微藻生長的重要環境因子，是影響微藻細胞生長、細胞內生物大分子組成和含量的重要因素，也是影響水生植物生長、繁殖、種群演替的一種關鍵生態因素。適宜的溫度是快速水華生長的必要條件，也是優勢種發生更替的重要環境因子。研究溫度對微藻生長的影響對湖泊污染治理提供理論基礎有著重要作用。光照是藻類主要能量來源，合適的光照會對微藻的生長產生積極作用，光照過強或過弱都會對微藻產生抑制作用。陳宇煒等[1]提出氣候變化(主要是光照、溫度變化)等對藻類的組成和演替產生非常重要的影響。晁建穎等[2]認為溫度是決定生態的一個極其重要的因子，例如綠藻僅適宜在較低溫度下增值，綠藻在較低溫度時有較強的競爭優勢，藍藻在較高溫度時有競爭優勢。EPPLEY等[3-4]對多個藻種進行調查，在大量試驗研究的基礎上，得到藻類增殖速率和溫度關系的經驗公式。銅綠微囊藻(Microcystis Aeruginosa)，藍藻門微囊藻屬，是光合自養型生物，具有很強的光合作用能力，且銅綠微囊藻生長周期短，不分層，易于培養，對外界敏感性強。小球藻(Chlorella ),綠藻門綠藻綱，是單細胞藻，對生長環境要求簡單，適應性較強，在海洋、淡水等區域分布較廣。自然水體中藻的種類和數量會根據季節的變化發生相應的改變，一般在晚春和初夏水體中綠藻易形成優勢種，而在夏天和初秋隨著溫度的升高，藍藻的數量會逐漸增加，并成為優勢種，但數量過高會導致藍藻水華的爆發。因此，研究微藻生長的環境條件，對于水環境污染和治理有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的藻種銅綠微囊藻(Microcystis Aeruginosa FACHB905)和小球藻(Chlorella)均購自中國科學院水生生物所淡水種庫。培養基采用BG-11培養基[5]，培養條件為25℃，t(光)t(暗)=12h12h，光照為8000lx。試驗所用的玻璃器皿均用稀鹽酸浸泡30min，用無菌水沖洗3次，再用滅菌鍋于121℃滅菌20min，烘干備用。

1.2 試驗儀器

PQX-250人工氣候箱：上海海向儀器設備廠，控溫精度±1℃，光照度0～12000lx；YM75立式蒸汽滅菌鍋：國產；UV2800紫外分光光度計：上海Unico公司；FL3500葉綠素熒光儀：PSI,捷克；普通血球計數板和三角瓶(高溫滅菌)等。

1.3 試驗方法

試驗藻種經過馴化培養后，達到試驗所需濃度，選用長勢較好的藻種在不同溫度下培養，控制溫度分別為10℃，14℃，18℃，22℃，26℃，光照為6000lx，pH為8，每個處理組設3個平行樣。試驗微藻的初始密度設置OD680為0.05(±0.001)。每天搖晃試驗藻3次以上，并隨機更換位置，使藻液均勻接受光照。

1.4 測定和計數方法

1.4.1 OD680測定

每天定時取銅綠微囊藻藻液1次，吸取2.5 mL放入比色皿中，紫外分光光度計測量OD680值。空白校準用BG-11營養液。

1.4.2 葉綠素熒光參數的測定

用葉綠素熒光儀測量微藻的葉綠素熒光參數，在測量之前各個處理樣品需要暗適應5 min。

葉綠素熒光技術是一種以光合作用理論為基礎，利用生物體內葉綠素研究和探測光合生理狀況以及外界環境對其細微影響的活體測定技術。葉綠素熒光動力學技術是用于評鑒作物耐受逆境能力的一項熱門技術，被稱為測定環境脅迫下光合功能和器官狀態的響應快速、無損傷的探針。[6-7]

1.4.3 細胞計數

采用一般的計數方法，用血球計數板計數。用血球計數板專用蓋玻片，每天同樣的時間取樣計數，整個取樣過程均在無菌條件下進行。準備好潔凈的計數板，蓋上蓋玻片，用液槍取1mL藻液從蓋玻片邊緣慢慢滲入，避免產生氣泡，并用吸水紙吸走多余的藻液，每個樣品計數兩次，如果誤差大于15%，需要重新取樣計數，求最終的平均數。

比生長速率計算公式[8]為

式中：X2為某時間間隔終結時的藻類現存量；X1為某一時間間隔開始時的藻類現存量；T2-T1為某一時間間隔。

1.5 數據處理分析

應用SPSS20.0軟件對數據進行分析和統計，用origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 溫度對小球藻和銅綠微囊藻吸光度值(OD680)的影響

不同溫度(10℃～26℃)對小球藻和銅綠微囊藻吸光度值(OD680)的影響見圖1。從圖可知小球藻比銅綠微囊藻更耐低溫，而銅綠微囊藻更喜高溫。溫度對小球藻OD680的影響如圖1(a)，當溫度為10℃時，前7天小球藻基本停止生長，7天以后小球藻可能適應較冷的環境，有一個緩慢上升的過程。在10℃時小球藻還能繼續生長，說明10℃并沒有到達小球藻耐受最冷溫度值。溫度到達14℃以上，小球藻OD680值呈快速上升的趨勢，說明小球藻在14℃以上時能夠迅速生長。26℃時小球藻生長最快，但14℃以上也能夠快速生長，并且14℃，18℃，22℃，26℃時小球藻的OD680值上升的趨勢是一致的，說明小球藻能夠適應較低的溫度。通過單因子方差分析可知，14℃時小球藻OD680的值與18℃，22℃，26℃時小球藻OD680的值存在顯著性差異(P<0.05)，通過不同溫度和小球藻OD680值相關性比較分析可知，溫度和小球藻OD680的值存在顯著性差異(P<0.05)，說明溫度對小球藻生長的影響呈正相關，在14℃～26℃溫度越高越能刺激小球藻的生長。

不同溫度對銅綠微囊藻OD680的影響如圖1(b)。溫度對銅綠微囊藻OD680的影響比較明顯，溫度與銅綠微囊藻OD680的變化呈正相關關系，且銅綠微囊藻比小球藻更不能耐受寒冷，當溫度低于14℃時，銅綠微囊藻OD680值明顯呈下降趨勢，說明銅鋁微藻在低于14℃環境下生長明顯受到抑制。當溫度高于18℃時，溫度越高銅綠微囊藻OD680值越高，銅綠微囊藻OD680與溫度呈正比關系，說明銅綠微囊藻是喜熱的一種藍藻。通過單因素方差分析可知，10℃時銅綠微囊藻OD680值與18℃，22℃，26℃時銅綠微囊藻OD680值有顯著性差異(P<0.05)。從圖1(c)可知，當溫度大于22℃時，小球藻OD680值大于銅綠微囊藻OD680值，當溫度高于22℃時，小球藻OD680值低于銅綠微囊藻OD680值，說明小球藻更耐較低的溫度，而銅綠微囊藻在較高溫度生長的更好。

圖1 不同溫度下兩種藻的OD值(OD680)的變化

2.2 不同溫度下小球藻和銅綠微囊藻藻細胞的生長特征

不同溫度小球藻和銅綠微囊藻藻生長情況見圖2，其特征生長速率如圖3所示。小球藻藻細胞的數量與溫度有關，溫度越高，小球藻生長的越好，但是在同樣的溫度條件下(22℃和26℃)銅綠微囊藻比小球藻生長的好，而在相對低溫情況下(14℃和10℃)，小球藻比銅綠微囊藻生長得好。說明小球藻比銅綠微囊藻更耐低溫，而銅綠微囊藻比小球藻更喜高溫。由此可以判斷以銅綠微囊藻為代表的藍藻在湖泊、河流和海洋中夏季生長得更好，也就是夏季更容易爆發藍藻；以小球藻為代表的綠藻在晚春和初夏生長得更好，綠藻會在藍藻之前爆發。兩種藻的比生長速率(第9天)如圖3，小球藻在低溫(10℃)時的比生長速率依然為正，說明小球藻在低溫時依然能夠生長，只是生長得比較緩慢，而銅綠微囊藻在低溫(10℃和14℃)時，比生長速率為負，說明銅綠微囊藻在低溫時生長基本停滯，在高溫時生長得更好。

通過單因素方差分析可知，小球藻在10℃ 時的藻細胞密度生長值與14℃,22℃時的藻細胞生長值存在顯著性差異(P<0.05),與26℃ 的顯著性差異更明顯(P<0.01)，說明溫度對小球藻生長的影響很大。通過溫度與藻細胞生長數量的相關性分析可知，溫度與細胞生長數量相關性非常顯著，說明溫度與細胞數量存在明顯的正相關關系。通過單因素方差分析可知，銅綠微囊藻在10℃ 的藻細胞數量與18℃,22℃,26℃的藻數量存在顯著性差異(P<0.05),而14℃的藻細胞數量與18℃,22℃,26℃的藻細胞數量也存在顯著性差異(P<0.05)。通過溫度和藻細胞數量的相關性分析可知，溫度和藻細胞數量相關性存在明顯的正相關關系。通過兩種藻生長曲線分析可知，在試驗溫度的范圍內，溫度與藻生長情況相關。

圖2 不同溫度條件下小球藻和銅綠微囊藻的生長曲線

圖3 不同溫度條件下小球藻和銅綠微囊藻第9天的比生長速率的變化

2.3 不通溫度下小球藻和銅綠微囊藻PSⅡ的最大光化學量子產量Fv/Fm

不同溫度對小球藻和銅綠微囊藻葉綠素熒光的影響如圖4，小球藻在26℃時，其最大光化學量子產量(Fv/Fm)處于平穩上升的趨勢，且值相對較大，10℃時小球藻的Fv/Fm相對最小，但表現出緩慢上升的趨勢，說明較低溫度時小球藻仍可以繼續生長。銅綠微囊藻的Fv/Fm根據溫度的不同，其變化趨勢更明顯，當溫度為10℃和14℃時，銅綠微囊藻的Fv/Fm呈下降趨勢，且溫度越低下降越明顯。當溫度較高(22℃，26℃)時銅綠微囊藻Fv/Fm表現出平穩較高的狀態，說明較低溫度能夠抑制銅綠微囊藻的生長，較高溫度更能促進銅綠微囊藻的生長。

圖4 兩種藻在不同溫度條件下的最大化學量子產量(Fv/Fm)的變化

溫度是影響生物生長的重要因素之一，對生物體內細胞酶的活性及生化反應的速率具有重要影響。[9]溫度是藻類進行光合作用的影響因子，通過控制光合作用的酶促反應或呼吸作用，直接影響浮游植物的生長繁殖。溫度是影響藻類生長繁殖的一個關鍵環境因子，適宜的溫度是微藻迅速生長繁殖的條件。許多研究表明[10-12]，溫度對藻類的生長影響比較顯著，高于光照、pH等環境因素，溫度對不同的藻類生長的影響有所差異。

3 結論

本試驗控制光照和pH，研究溫度對小球藻生長的影響，結果表明，溫度對小球藻和銅綠微囊藻生長的影響有差異。當溫度為10℃時，小球藻生長緩慢，而銅綠微囊藻生長基本停止甚至死亡。小球藻在10℃以上隨著溫度的上升其生長速度迅速，30℃是小球藻的最適宜溫度。不同研究者的研究結果各有不同,可能是培養基不同或控制的光照、pH不同所致。

1)小球藻最適宜的生長溫度為26℃。小球藻在低溫10℃也能繼續生長，說明小球藻能夠耐受低溫，更容易生長在春季的水環境中。

2)銅綠微囊藻最適宜的溫度也為26℃。銅綠微囊藻在10℃和14℃的相對低溫時，生長表現停滯甚至死亡，說明銅綠微囊藻更喜高溫，容易生長在夏季的水環境中。