一種改良的紅豆杉成熟針葉總RNA 提取方法

李德文 楊 超 付金穎 劉 英 于莉莉 付玉杰

(東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室， 哈爾濱 150040)

1 引 言

紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉屬(TaxusLinn.)植物中分離出的一種二萜類生物堿，因具有廣譜的抗癌活性和獨特的抗癌機制而備受青睞。研究者通過研究紫杉醇生物合成過程的某些關鍵性酶的發現、克隆和高效表達，實現紫杉醇高效、穩定生產[1]。近年來，研究者已從紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger) Rehd.)愈傷組織、懸浮細胞和幼嫩針葉材料中克隆了紫杉醇生物合成相關的關鍵酶基因[2]，并對這些基因轉錄水平的表達與紫杉烷類化合物的合成之間的關系展開了相關研究[3]。紅豆杉分子標記研究是以基因組DNA為基礎，圍繞遺傳變異與親緣關系和紫杉醇含量方面展開[4,5], 文獻[6,7]利用紅豆杉轉錄組進行高通量測序進而發掘基因表達譜多態性標記(EST-SSRs)，以及開展紅豆杉遺傳多樣性的分析、分子標記輔助育種、遺傳圖譜構建和功能基因的挖掘。目前在紅豆杉分子生物學研究方面已經取得了很大進展，但是圍繞環境因子對紫杉醇合成路徑基因表達調控開展的工作較少，基于以紅豆杉成熟針葉為材料的RNA提取還比較困難，因此需要建立一種穩定高效的成熟針葉RNA提取體系。

在RNA提取過程中首先需要加入適量蛋白質變性劑，如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯仿、異硫氰酸胍、十二烷基磺酸鈉(SDS)等使蛋白質變性與核酸分離、沉淀[8]，即TRIzol法(異硫氰酸胍)[9]、CTAB法[10]、SDS-酚法[11]等是幾種常見的RNA提取方法。影響RNA提取效果的主要因素包括多酚、多糖、蛋白及DNA的污染等，因此，RNA提取方法并不是通用的，不同植物或者同一植物不同組織RNA提取都可能需要采用不同的處理方法。由于杉科針葉中含有較多難以去除的萜烯、多糖、多酚等代謝物[12]，傳統的RNA提取方法從產量、產物質量上都不能滿足目前紅豆杉研究的需要。本研究根據RNA提取要點，以紅豆杉屬代表性植物南方紅豆杉針葉為材料，提出一種改良后的成熟針葉RNA提取方法，得到的RNA不僅完整度好，而且產率高，有利于開展紅豆杉成熟針葉紫杉醇合成路徑基因表達分析以及轉錄組等分子生物學的研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nano Photometer N60超微量紫外分光光度計、Hettich Mikro220R 低溫高速離心機(天力科技開發有限公司); 844-070-682 EasyCycler Gradient 96 PCR儀(北京元業伯樂有限公司); DYCP-31DN 水平電泳槽和核酸電泳儀(北京六一公司); Dolphin-Doc Plus凝膠成像系統 (北京銘泰佳科技有限公司); Hirayama HVE-50高壓滅菌鍋(上海天呈科技有限公司); DFD-700 恒溫水浴鍋(邢臺潤聯科技開發有限公司)。

TRIzol(上海生工公司); 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，分析純，龍騰化工); 焦炭酸二乙酯(DEPC，純度≥97%) 、LiCl (分析純)購于納川生物公司; NaAC(分析純)、十二烷基磺酸鈉(SDS, 分析純)、乙二胺四乙酸(EDTA，分析純)、 NaCl (分析純)、KAC (分析純)、無水乙醇(分析純)、氯仿(分析純)、異戊醇(分析純)、β-巰基乙醇(β-ME，純度≥99.9%)購于天津永大化學試劑公司; 聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分析純)、交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP，分析純)購于美國Simga公司; 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，分析純，上海研生公司)。實驗用水為超純水。

2.2 實驗前處理

RNA提取之前，所有需要使用的實驗用品在37℃下用0.01% DEPC溶液過夜處理，后在高溫高壓下滅菌(121℃，20 min)。研缽在180℃下烘烤6 h。所有溶液的配制需在37℃下用0.1% DEPC處理水過夜處理后配制，并高溫高壓滅菌處理。

2.3 實驗材料

選取紅豆杉屬代表性植物南方紅豆杉(Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)三年生的幼苗為實驗材料，栽培于東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室溫室中，分別選取新鮮的幼嫩針葉和成熟針葉。

2.4 RNA提取方法

2.4.1TRIzol方法分別稱取新鮮嫩針葉和成熟針葉0.1 g，放于液氮中研磨。加入1 mL TRIzol試劑振蕩混勻(30～60 s)，冰上放置10 min， 4℃ 12000 r/min離心10 min。吸取上清液轉到新管中，加入200 μL氯仿，振蕩混勻(30～60 s)，室溫放置5 min， 4℃ 12000 r/min離心10 min。吸取上清液，加入預冷的異丙醇500 μL，振蕩混勻(30～60 s)，4℃放置20 min， 12000 r/min離心10 min，得到RNA白色片狀沉淀。棄去上清液，加入1 mL 75%(V/V)乙醇，顛倒并渦旋5～10 s， 4℃ 12000 r/min離心3 min，重復兩次，棄上清液，室溫干燥5～10 min。加入30 μL DEPC處理水溶解RNA，——70℃保存備用。

2.4.2CTAB法稱取新鮮成熟針葉0.5 g，液氮研磨，加至60℃預熱的1 mL CTAB提取液中 (2% CTAB、2% PVP、100 mol/L Tris-HCl (pH=8)、25 mol/L EDTA、2 mol/L NaCl, 滅菌后加入0.1 g PVPP和67 μLβ-ME); 混勻后于60℃烘箱反應15 min; 4℃ 12000 r/min離心10 min，取上清液，加入700 μL氯仿-異戊醇(24∶1,V/V)，劇烈振蕩混勻，重復一次; 4℃12000 r/min離心10 min，取上清液，加入600 μL異丙醇，-20℃沉淀30 min。4℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清液，再離心2 min; 沉淀用75%乙醇洗滌兩次，真空干燥2～5 min; 加入150 μL DEPC溶解RNA，再加入50 μL 8 mol/L LiCl，4℃沉淀，過夜。次日，4℃12000 r/min離心20 min，收集沉淀。用75%乙醇洗滌2次，真空干燥5～10 min; 加入30 μL DEPC處理水，-70℃保存備用。

2.4.3SDS-酚法稱取新鮮成熟針葉0.1 g，液氮研磨，轉入1.5 mL離心管中，加入1 mL SDS提取液 (0.1 mol/L NaAC，50 mol/L EDTA (pH=8)、1 mol/L NaCl、3% PVP)，調節至pH 5.5后加3% (m/V)SDS，用前加5%(V/V)β-ME ，混合后在65℃水浴10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。取上清液，分別加入1/2體積的水飽和酚和氯仿，置冰上10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAC (pH=4.8)和1/3體積的無水乙醇，冰上靜置30 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。 取上清液，加2倍體積的乙醇，在冰上沉淀核酸2 h，然后4℃12000 r/min離心10 min，棄上清液。加入700 μL預冷的NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，冰上放置5 min，4℃ 12000 r/min離心20 minn。加入75 μL DEPC溶解，再加入等體積4 mol/L LiCl，4℃沉淀過夜后，4℃12000 r/min離心30 min，棄上清液，加入70%乙醇清洗沉淀，離心，棄上清液， 干燥5～10 min，溶于50 μL DEPC處理水中。

2.4.4改良CTAB-LiCl法取新鮮紅豆杉成熟針葉液氮研磨后的樣品0.5 g，加入經過65℃預熱的提取裂解緩沖液1 mL，RNA提取緩沖液配制: 0.1 mol /L Tris-HCl (pH= 8.0)，0.05 mol/L EDTA (pH=8.0)， 2% CTAB (W/V)，2% PVP (W/V)，2 mol /L NaCl，在使用前加入5%β-ME (V/V)，渦旋劇烈振蕩1 min，65℃ 溫育30 min，期間混勻數次。加等體積氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)，劇烈振蕩2 min，13000 r/min 離心10 min，吸取上清液。反復抽提2次。加入1/4 體積的LiCl(6 mol/L)，混勻，-20℃放置2～3 h，13000 r/min 離心10 min，去上清液，沉淀RNA中加入1/20體積DEPC處理的無菌水，加入1/20體積NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，再加入預冷的無水乙醇1.2 mL混勻，于——70℃放置30 min，13000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀RNA。用70%乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清液，并干燥5～10 min， 溶于40 μL DEPC處理水。

2.5 RNA的純度和產率分析

將不同方法提取的總RNA樣品稀釋50倍，用超微量紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm 處的吸光值，用A260/A280比值衡量樣本的純度，并計算RNA的產率。取4 μL RNA樣品與2 μL (6 × Loading-buffer)混勻，用1×TAE電泳液和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統下拍照成像。

2.6 cDNA的合成和PCR(RT-PCR)

cDNA的合成采用BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒(江蘇南京碧云天生物公司)，具體步驟:3 μL RNA(100～500 ng/μL)、1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)和8 μL ddH2O混勻，65℃孵育5 min，置于冰上冷卻，再依次加入4 μL 緩沖液(5×Buffer)、1 μL RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor，20 U/μL)、2 μL dNTP、1 μL 逆轉錄酶(RT-MLV，200 U/μL)，共20 μL，42℃反應1 h，80℃反應10 min，置冰上終止反應，得到單鏈cDNA。PCR反應總體系20 μL:模板cDNA 2 μL、引物18S各1.5 μL，PCR-Mix (Easy-LoadTMPCR Master Mix，江蘇南京碧云天生物公司) 10 μL、ddH2O 5 μL。PCR擴增體系: 94℃ 3 min， 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30次循環，72℃ 10 min，4℃保溫。引物序列應用報道的紅豆杉18S rRNA序列[13](18S-F:5′-GTGCACATCCCGACTCT-3′, 18S-R:5′-GCGATCCGTCGAGTTATCAT-3′)進行擴增。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 結果與討論

3.1 不同方法提取紅豆杉針葉總RNA的質量分析

采用4 種方法提取紅豆杉成熟針葉的總RNA，結果表明，不同方法提取的RNA質量差別較大。首先采用TRIzol法提取幼嫩針葉和成熟針葉的RNA，以幼嫩針葉為材料，提取產物電泳后28S和18S條帶清晰， RNA未降解(圖1A) ，表明簡單快捷的TRIzol法適合幼嫩針葉RNA的提取。以成熟針葉為材料，TRIzol法提取RNA電泳時僅有5S條帶出現(圖1B)，表明RNA發生了降解。與幼嫩針葉相比，液氮研磨后加入TRIzol試劑，緩沖液體系呈深綠色(圖2)，一方面是由于針葉中酚類物質的干擾，酚類物質氧化影響緩沖液的顏色，另一方面可能由于成熟針葉中代謝產物較幼嫩針葉含量增多，如紫杉醇、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ等在葉中積累，含量升高[14]，其中一類或者一種產物明顯干擾TRIzol作用，導致緩沖液呈黏稠態，沒有抑制RNAase活性，導致提取產物RNA降解。說明TRIzol法只適用于紅豆杉幼嫩針葉RNA的提取，因此對成熟針葉的RNA提取方法進行篩選和改進。采用CTAB法提取成熟針葉的RNA，RNA產物電泳后條帶明顯彌散，拖尾嚴重，存在嚴重的降解現象，并且有明顯的DNA條帶干擾(圖3C); RNA樣品中有DNA污染時，會影響基因表達量的測定。采用SDS-酚法提取RNA，電泳后28S和18S條帶分辨不清晰(圖1D)，RNA發生降解; 采用改進的CTAB-LiCl法提取RNA，電泳后，28S和18S條帶清晰，亮度高， DNA污染較少， RNA質量好(圖1E)。改進的CTAB-LiCl法綜合CTAB法和SDS-酚法，使用氯仿/異戊醇可將不穩定的DNA及其它雜質抽提出來，而穩定的RNA留于上清液中，從而將RNA和DNA有效分離。耿學軍等[15]在提取沙蔥總RNA時加入250 μL 3 mol/L NaAc溶液去除DNA，提取效果良好，研究表明，在酸性條件下RNA穩定性高于DNA，NaAc可選擇性沉淀RNA，并將DNA留在溶液中。因此，CTAB-LiCl法結合酸性條件、高鹽溶液(3 mol/L NaAc)和LiCl等減少DNA、多糖污染的步驟，最終提取的RNA質量完整、產率高。

圖1 4種方法提取紅豆杉針葉中總RNA的電泳檢測結果TRIzol法提取紅豆杉的(A)幼嫩針葉和(B)成熟針葉的RNA; (C)CTAB法提取紅豆杉成熟針葉的RNA; (D)SDS酚法提取紅豆杉成熟葉的RNA; (E)改良CTAB-LiCl法提取紅豆杉成熟針葉的RNA。Fig.1 Total RNA electrophoresis results from needles by four methodsExtraction of (A) young needles and (B) mature needles of Taxus chinensis by TRIzol method; (C) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by CTAB method; (D) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by SDS phenol method; (E) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by improved CTAB-LiCl method

圖2 (A) 紅豆杉針葉(a,成熟針葉; b, 為幼嫩針葉); (B) 研磨0.1 g材料中加入1 mL TRIzol試劑后的裂解液(a,成熟針葉，b,幼嫩針葉)Fig.2 (A) Taxus chinensis (Pilger) Rehd.) needles (a, mature needles; b, younger needles); (B) 1 mL TRIzol solution was added into 0.1 g of grinding material (a, mature needles, b, young needles)

3.2 不同方法提取紅豆杉針葉總RNA的純度及其產率

采用紫外分光光度法分析RNA的純度與產率，相應的A260/A280比值常用于核酸樣品純度評價。質量較好的核酸樣品的標準為A260/A280>1.8[16]。本研究檢測TRIzol試劑盒法提取出紅豆杉幼嫩和成熟針葉的RNA，及其余3種方法提取紅豆杉成熟針葉的RNA的質量，結果表明，TRIzol法提取RNA的A260/A280>1.8，表明RNA中的蛋白和其它物質干擾較少，CTAB法和SDS-酚法提取RNA的A260/A280<1.8，表明RNA中蛋白或者其它有機物的污染比較明顯，而CTAB-LiCl法提取RNA的A260/A280在1.9～2.0之間，表明RNA受污染比較少。由于LiCl是一種強脫水劑，可以降低RNA的溶解度，使部分多糖留在溶液中進而選擇性地沉淀大分子RNA[17]，對于不同的植物，所用LiCl的濃度有所不同，在提取白木香RNA中選用4 mol/L LiCl選擇性沉淀RNA[18]，在紫藤種子RNA提取中選擇8 mol/L LiCl沉淀[19]。本研究中采用的CTAB-LiCl法，通過優化后，選擇在提取上清液中加入6 mol/L LiCl，適合于除去多糖等一些物質的干擾，提高RNA的質量。

RNA濃度分析表明，TRIzol法提取紅豆杉幼嫩針葉RNA濃度為135 μg/mL (表1)，成熟針葉中提取RNA不完整，未測出RNA濃度; 應用CTAB法、SDS-酚法、CTAB-LiCl法提取的紅豆杉成熟針葉RNA濃度分別為269、205和428 μg/mL。

將不同方法提取的總RNA樣品稀釋50倍，用超微量紫外分光光度計檢測在波長260 nm和280 nm 處的吸光值，用A260/A280值衡量樣本的純度，并計算RNA的產率(yield):

RNA yield (μg/g)=A260N40(μg/mL)V/W

(1)

式中，N為稀釋倍數， 40 μg/mL相當于1個A260單位的RNA含量，V為體積，W為樣品重量(g)。 取4 μL RNA樣品與2 μL (6 × Loading-buffer)混勻，用1×TAE電泳液和1.2%的瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統下拍照成像。RNA產率分析結果表明，CTAB-LiCl法提取RNA的產率最高，分別為CTAB法和SDS-酚法提取的RNA產率的1.37和1.24倍(表1)。針葉植物中多酚含量比較高，氧化后的多酚物質會結合于RNA上，通過離心將其一并去除，降低了RNA的產率[12]。王玉成等[8]研究發現，RNA提取過程中加入適量β-ME強還原劑，可避免多酚物質被氧化。伍艷芳等[20]和張燕梅等[21]分別在提取樟樹葉片、劍麻組織的總RNA時，均在預處理液中加入2%β-ME，抑制酚類物質的干擾，而劉潔等[12]研究改良云杉針葉總RNA時，加入5%β-ME。本實驗經過優化選擇加入5%β-ME，有效抑制了酚類物質對RNA的影響，提高了RNA的產率。

表1 4種方法提取紅豆杉針葉RNA的純度及產率比較

Table 1 Comparison of total RNA purity and yield from Yew needles by 4 extraction methods (n=3)

方法Methods材料SpeciesA260A280A260/A280RNA濃度RNA concentration(μg/mL)產率Yield(μg/g·FW)TRIzol法TRIzol method幼嫩葉Young needles0.1187±0.0040.061±0.0021.78±0.42135.3±2.665.2±2.1CTAB法CTAB method成熟葉Mature needles0.212±0.00250.152±0.0031.39±0.01269.3±2.3127.2±1.5SDS酚法SDS phenol method成熟葉Mature needles0.14±0.00470.105±0.0761.33±0.02205.3±2.3140.0±4.7改良CTAB-LiCl法Modified CTAB-LiCl method成熟葉Mature needles0.219±0.0140.117±0.0091.88±0.03428.3±3.4174.9±10.8

3.3 提取紅豆杉針葉RNA的特定基因的克隆

分別將TRIzol法和CTAB-LiCl法提取的紅豆杉針葉RNA進行反轉錄，得到的cDNA片段大小在200～1500 bp范圍內，符合常規的反轉錄結果(圖3)。

以上述cDNA為模板，利用基因18S rRNA為引物進行PCR擴增，PCR產物凝膠電泳結果顯示，18S rRNA在紅豆杉幼嫩、成熟針葉中均擴增出與預期大小一致的片段，以成熟針葉為材料采用CTAB-LiCl法提取RNA，反轉錄后擴增條帶清晰且特異性強(圖4)。進一步將條帶回收并測序，得到的序列在GenBank進行BLAST比對后確認為紅豆杉的18S rRNA基因序列。說明改良的CTAB-LiCl法提取的紅豆杉RNA，反轉錄結果好，可以應用于后續基因表達等分子生物學研究。

圖3 紅豆杉針葉RNA的反轉錄結果M: DNA marker; 1: 改良CTAB-LiCl法提取紅豆杉成熟葉總RNA反轉錄cDNA， 2: TRIzol法提取紅豆杉幼嫩葉總RNA的反轉錄cDNA， cDNA濃度: 1 (20 ng/5 μL), 2 (15 ng/5 μL)。Fig.3 Electrophoretogram of transcription of total RNA from needlesM, DNA marker, 1, Total RNA transcription from mature needles by CTAB-LiCl method extraction, 2, Total RNA transcription from young needles by TRIzol extraction. cDNA concentration: 1, 20 ng/5 μL; 2, 15 ng/5 μL.

圖4 RNA反轉錄后進行18S rRNA基因擴增的結果M: DNA marker; 1: 陰性對照(水作為模版)，2: 幼嫩針葉擴增18S rRNA基因，3: 成熟針葉擴增18S rRNA基因。Fig.4 Electrophoretogram of 18S rRNA gene amplified with cDNA after RNA transcriptionM: DNA marker, 1: Negative control (RT-PCR amplification of water template), 2: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of young needles, 3: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of mature needles.

4 結 論

采用改進的CTAB-LiCl法能有效從紅豆杉成熟針葉中提取純度較高、完整性較好的RNA，A260/A280比值為1.9～2.0，28S、18S的電泳條帶清晰,總RNA產率較其它方法高。本研究中建立的紅豆杉成熟針葉RNA的提取方法為紅豆杉等針葉植物分子生物學的研究奠定良好的技術基礎，同時也對其它富含多糖多酚以及植物表皮蠟質結構較多的試驗材料RNA提取具有很好的借鑒意義。