熒光/表面增強拉曼散射雙模式納米光學探針的構建及性能研究

宿 健， 張谷令， 彭洪尚*

(1. 中央民族大學 生命與環境科學學院， 北京 100081; 2. 中央民族大學 理學院， 北京 100081)

1 引 言

隨著納米復合材料的不斷發展，整合多種分析方式的多模式納米探針越來越多地應用于生物成像與傳感等領域。熒光分析法是一種眾所周知的分析檢測方法，由于其具有高靈敏度、良好的選擇性和非侵入性等優點，在生物醫學領域得到了廣泛應用。但目前大部分熒光有機染料具有較寬的發射譜，且易發生光學漂白，所以需要發展更加靈敏且穩定的探針。表面增強拉曼光譜(SERS)是一種能夠反映分子特征結構的分子振動光譜，它具有指紋分析特征、較好的光穩定性、譜線帶寬較窄、受生物樣品自身熒光及水的干擾小和無損傷的定性定量分析等優點，在細胞領域的研究及應用發展迅速。但是單一的SERS檢測存在一定不足，在實際檢測過程中難以及時地聚焦定位檢測分子，從而會影響檢測效率。若將熒光與SERS信號整合到同一納米粒子上，使該粒子同時具有熒光和SERS成像能力，便可首先通過熒光信號進行快速定位和成像，再用SERS技術進行多目標跟蹤和定量研究，從而能夠有效解決熒光和SERS成像技術存在的問題。

近年來，基于熒光與表面增強拉曼散射技術的雙模式納米探針在生物醫學領域得到廣泛關注，研究者們提出了多種雙模式納米顆粒的制備方案。崔一平等[1-4]利用金核銀殼納米棒作為SERS增強基底，表面連接拉曼分子，然后通過二氧化硅對其進行包覆，再通過在二氧化硅殼層連接量子點作為熒光源，即合成雙模式探針，并將其成功用于免疫檢測。另一種常用的制備方法是首先在金納米棒或納米球聚集體表面連接拉曼分子，然后表面吸附熒光物質以形成雙模式納米顆粒，其可用于標定癌細胞和免疫檢測。Kim等[5]和Yu等[6]制備了以二氧化硅包覆銀納米顆粒作為拉曼增強基底的納米探針，其表面吸附拉曼分子及熒光分子,可用于分子識別和生物傳感。這些雙模式探針制作過程較為繁瑣復雜，且熒光信號源(有機熒光分子或量子點)均吸附在納米顆粒表面，易受溶劑及雜質等影響發生猝滅。Lee[7]通過共沉淀法制備二氧化硅納米顆粒，并在二氧化硅表面修飾銀納米顆粒，然后依次連接拉曼分子與熒光分子以制備雙模式納米探針。Kim等[8]通過油包水型微乳液法將染料分子嵌入二氧化硅微球中，然后通過化學鍍層法在二氧化硅表面包覆活性銀，再修飾拉曼分子形成雙探針傳感器，其中摻雜的染料熒光信號可用于分子識別的快速顯現系統，SERS信號則用于顯示特定分子相互作用的信號。該雙模式探針通過二氧化硅包覆熒光染料分子，使熒光分子與外界環境隔離開來，可有效地避免溶劑及雜質的猝滅影響。但該雙模式探針制作過程極其復雜，且整個實驗過程均在有機溶劑中進行，會產生一定的生物毒性，因此對納米探針應用于細胞及生物組織存在一定的影響。

本文提出了一種新型的具有熒光及SERS雙模式的復合納米粒子制備方法，首先采用再沉淀法制備二氧化硅包覆香豆素6的納米顆粒，其表面靜電吸附多聚賴氨酸分子(PLL)，然后通過PLL表面氨基對銀離子的絡合作用，將銀納米顆粒原位固定在PLL表面，最后在銀納米顆粒表面吸附拉曼分子即合成雙模式納米探針。該探針以染料有機分子作為熒光信號源，以PLL表面的銀納米顆粒作為SERS增強基底，通過拉曼活性分子提供SERS信號。二氧化硅層可有效防止熒光分子受外部銀納米顆粒猝滅影響，PLL分子層不僅能夠給銀納米顆粒提供附著點，還能夠提高納米顆粒的生物相容性。通過不同激發光照射該探針粒子，納米探針分別產生較強的熒光信號和高信噪比的SERS信號。

2 實 驗

以羅丹明6G(R6G)為拉曼分子的探針制備過程及信號產生過程如圖 1 所示。

2.1 材料與儀器

香豆素 6(C6)、聚苯乙烯(PS)、多聚賴氨酸(PLL，MW 3w-7w)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)、四氫呋喃(THF)、羅丹明6G(R6G)、羅丹明B(RhB)、4,4-聯吡啶(4,4′-Bipyridine)、硝酸銀(AgNO3)均購自Sigma-Aldrich。抗壞血酸(AA)和氨水購自國藥集團化學試劑有限公司。全部試劑均購買后直接使用，實驗過程中均使用18 MΩ/cm去離子水。

實驗過程中納米顆粒的發射光譜由日本日立公司生產的型號為F-4500的光譜儀測得；樣品的消光光譜由日本分光株式會社生產的型號為V-550 的紫外分光光度計測得；樣品的透射電子顯微鏡成像由日立公司生產型號為 JEM 1400EX的透射電子顯微鏡測得；實驗中利用馬爾文公司生產的型號為 Nano ZS90的激光粒度儀對納米顆粒的動態光散射粒徑進行表征；利用LabRAM HR800顯微共聚焦激光拉曼光譜儀表征SERS信號(激發光為632.8 nm，曝光時間為10 s)。

圖1 雙模式光學探針制備過程示意圖

2.2 樣品制備方法與步驟

2.2.1 PLL包覆熒光納米探針的制備

PLL包覆熒光納米探針的制備方法是改進的再沉淀-包覆法[9-10]，首先配置溶解于THF中的C6(400×10-6)、PS(2 000×10-6)和DTS(2 000×10-6)溶液，然后按照質量比3∶47∶50進行混合，最終混合溶液濃度為200×10-6，隨后取0.5 mL混合液在超聲震蕩條件下迅速注入到 pH 值為9的含有0.02 mg/mL PLL的去離子水中，由此產生的懸浮液靜置 2 h后，將其在去離子水中透析24 h以除去有機溶劑，即得到PLL包覆的熒光納米探針(C6@PLL NPs)。

2.2.2 銀納米顆粒包覆的熒光納米探針的制備

將1 mL 濃度為1 mol/L 硝酸銀溶液在劇烈攪拌條件下加入8 mL PLL包覆的熒光納米顆粒(C6@PLL NPs)溶液中，待其混合均勻后靜置于50 ℃水浴環境中6 h，隨后用去離子水透析溶液，去除未被PLL還原的銀離子，即得到表面吸附小顆粒銀的納米顆粒(C6@PLL@Ag NPs)。然后取0.1 mL濃度為0.02 mol/L的 AA在攪拌環境下逐漸滴入透析后的納米顆粒中，振蕩反應12 h，PLL表面的小顆粒銀進行二次生長，再對上述溶液進行透析以去除未反應的AA，即得到銀納米顆粒包覆的熒光納米探針溶液(C6@PLL@Ag(AA) NPs)。

2.2.3 銀納米顆粒吸附拉曼分子

取8 mL C6@PLL@Ag(AA)溶液進行高速離心30 min(10 000 r/min)，然后將沉淀分散至2 mL去離子水，隨后與濃度為10-5mol/L的拉曼分子溶液按體積比9∶1進行混合，室溫下震蕩12 h后，將該溶液滴在硅片上，待溶劑蒸發后置于拉曼光譜儀樣品臺上進行測試。

3 結果與討論

3.1 雙模式光學探針的表征

雙模式納米探針的結構如圖1所示，其中熒光分子香豆素6(C6)隨機地摻雜于納米顆粒核心，PS和DTS作為核心基質材料，DTS遇水水解成二氧化硅，進而對核心進行包覆形成二氧化硅殼層，二氧化硅帶負電性，吸附帶正電的多聚賴氨酸分子形成PLL包覆的納米顆粒。然后通過原位還原方法在納米顆粒表面生長銀納米粒子，多聚賴氨酸表面的氨基將電子轉移給吸附的銀離子，銀離子還原成銀原子并成核，進而形成小顆粒納米銀[11-13]，之后通過AA還原PLL吸附的大量銀離子，以小顆粒納米銀為種子，繼續在PLL表面生長成為大粒徑的銀納米顆粒。

PLL包覆熒光納米探針(C6@PLL NPs)的形貌通過透射電子顯微鏡照片(TEM)進行表征，如圖2(a)所示，納米顆粒呈球形，表面光滑，顆粒分散性較好，右上角插圖中的動態光散射表征結果顯示納米顆粒水合粒徑平均值在190 nm左右。圖2(b)是C6@PLL@Ag NPs的TEM成像，可以發現納米顆粒表面生成大量粒徑極小的銀納米顆粒，粒徑大約為5 nm左右，這是由于多聚賴氨酸將銀離子原位還原為銀納米顆粒，插圖中動態光散射水合粒徑大約為180 nm左右，略小于C6@PLL NPs粒徑，猜測可能是由于表面生成的銀顆粒對疏松的PLL層產生壓縮作用。圖2(c)為C6@PLL@Ag(AA) NPs透射電子顯微鏡成像圖，從圖中可以看出PLL表面銀納米顆粒進一步生長，顆粒粒徑達到50 nm左右，部分銀顆粒發生聚集，易于產生SERS熱點[14-16]，進而能夠極大地增強其表面吸附分子的拉曼信號，所以C6@PLL@Ag(AA) NPs中的銀納米顆粒可用于SERS基底。圖3為C6@PLL NPs、C6@PLL@Ag NPs和C6@PLL@Ag(AA) NPs的消光光譜。C6@PLL NPs 位于430～470 nm左右的寬消光峰為熒光分子C6的特征峰[17-18]。C6@PLL@Ag NPs的消光光譜位于400～500 nm左右，略高于C6@PLL NPs，因為PLL表面的小顆粒銀存在表面等離子體共振吸收[19-20]。而C6@PLL@Ag(AA) Nps在420 nm處存在較高消光峰[21-24]，為其表面大顆粒銀的特征消光峰。消光光譜進一步證明熒光納米探針表面復合尺寸較大的銀納米顆粒。

圖2 雙模式納米探針制備過程中的TEM圖像。(a)C6@PLL；(b)C6@PLL@Ag NPs(50 ℃下加入硝酸銀溶液6 h后)；(c)C6@PLL@Ag(AA)NPs (加入AA后) 。

Fig.2 TEM image of the process preparing the dual modenanoprobe. (a)C6@PLL NPs. (b)C6@PLL@Ag NPs(reacting 6 h in 50 ℃ after adding AgNO3). (c)C6@PLL@Ag(AA)NPs(after adding AA).

圖3 C6@PLL NPs、C6@PLL@Ag NPs和C6@PLL@Ag(AA) NPs的消光光譜。

Fig.3 Extinction spectra of C6@PLL NPs, C6@PLL@Ag NPs and C6@PLL@Ag(AA) NPs.

3.2 雙模式納米探針的SERS及熒光特性

由于適量銀納米顆粒聚集能夠產生SERS增強作用，所以我們利用吸附在PLL表面的聚集銀納米顆粒作為SERS基底，相比傳統的氯離子誘導產生的聚集[25-26]，本結構更容易控制且不易產生沉降作用。為證明該雙模式探針的廣泛適用性，我們選用同樣濃度的羅丹明6G(R6G)、羅丹明B(RhB)和4,4-聯吡啶(4,4′-Bipyridine)在相同條件下進行SERS測試。圖4為拉曼分子R6G分別吸附在C6@PLL NPs和C6@PLL@Ag(AA)NPs上的SERS光譜(其中插圖為R6G的分子結構式)，圖中可以看出在613，774，1 187，1 313，1 364，1 511，1 650 cm-1處觀察到了R6G的拉曼峰。613 cm-1處峰對應C—C—C環面內彎曲振動；774 cm-1處峰對應C—H面外彎曲振動；1 187 cm-1處峰對應C—H面內彎曲振動和C—C伸縮振動，1 313 cm-1處峰為C—C伸縮振動和C—N伸縮振動共同產生，1 364，1 511，1 650 cm-1處峰由C—C伸縮振動產生[27-30]。相比于C6@PLL NPs，R6G吸附于C6@PLL@Ag(AA)NPs后產生明顯的SERS信號，SERS活性增強明顯。

此外，我們將羅丹明B和4，4-聯吡啶分別吸附于C6@PLL@Ag(AA)NPs表面，并進行SERS光譜表征(圖5)，其中插圖分別為其分子結構式。吸附RhB后，SERS光譜中620 cm-1處峰為芳香族環的彎曲振動；1 200 cm-1處峰對應C—H面內彎曲振動；1 280 cm-1處峰對應C—C橋帶伸縮振動；1 510，1 359，1 531，1 649 cm-1處峰由芳香族環伸縮振動產生[31-33]。吸附4，4-聯吡啶后，SERS光譜中1 018 cm-1處峰對應全對稱環呼吸振動峰；1 295 cm-1處為兩個吡啶環之間的碳碳伸縮振動峰；1 611 cm-1處為吡啶環伸縮振動峰[34-35]。

雙模式探針的熒光性能通過熒光光譜進行表征，如圖6所示，在450 nm波長激發下，香豆素6產生位于490 nm左右的發射峰，即為納米探針的熒光信號。由于二氧化硅層能夠有效隔絕香豆素6與表面金屬銀以及溶劑的接觸，所以可以避免熒光分子非輻射躍遷導致的能量損失，從而避免熒光猝滅，實現雙模式檢測。從圖4和圖5可以看出，當用632.8 nm的光激發樣品時，能夠得到強烈的SERS信號；同時從圖6中看出，當用450 nm的光激發樣品時，能夠得到較強的熒光信號。這表明雙模式探針的熒光和SERS信號能夠通過選擇不同激發光波長分別產生，從而避免相互影響，進而提高檢測的準確性。

圖4 R6G吸附在C6@PLL上的SERS光譜及雙模式納米探針中R6G的SERS光譜

Fig.4 SERS spectra obtained from R6G tagged C6@PLL and dual mode nanoprobes

圖5 雙模式納米探針中RhB和4,4-聯吡啶的SERS光譜

Fig.5 SERS spectra obtained from dual mode nanoprobes of RhB and 4,4′-Bipyridine

圖6 雙模式納米探針的熒光光譜

4 結 論

本文通過簡單易制的方法制備了一種具有熒光及表面增強拉曼信號的雙模式納米探針，該探針具有核殼型結構，在二氧化硅包覆的核心部分摻雜C6分子，以產生熒光信號，二氧化硅表層吸附具有良好生物相容性的多聚賴氨酸分子(PLL)，然后在PLL表面復合銀納米顆粒形成SERS信號的基底，最后通過吸附拉曼分子獲得SERS信號。該探針通過450 nm光激發產生熒光信號，并通過632.8 nm光激發產生SERS信號。這種具有高信噪比光學信號的雙模式納米探針在多模態探針領域具有廣闊的應用前景。