辣椒種子貯藏蛋白質亞基構成及親緣關系分析

胡志輝， 陳禪友

[江漢大學生命科學學院/湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術研究中心，湖北武漢 430056]

辣椒(CapsicumannuumL.)現已成為中國的重要蔬菜和調味品，生產上迫切需要一些優質、抗病、高產的優良品種，加強辣椒種質資源的親緣關系研究，掌握種質資源的分類地位和親緣關系是辣椒品種選育上一個新臺階的重要途徑[1]。種子貯藏蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱SDS-PAGE)成為研究小麥、蕓薹屬、扁蓿豆、菜豆等植物親緣關系的有效手段[2-5]，而辣椒種質資源遺傳多樣性研究報道較少[6-12]。本試驗運用SDS-PAGE技術分析辣椒種子貯藏蛋白亞基構成，研究辣椒種質資源的遺傳多態性，確定辣椒3個主栽變種12個品種之間的親緣關系，為辣椒新品種選育工作的開展提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料均為成熟的辣椒種子(表1)，由湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術研究中心提供。

表1 供試辣椒品種名稱、來源及主要特征特性

1.2 種子貯藏蛋白的提取及電泳

參照胡志輝等的方法[13-14]提取辣椒種子貯藏蛋白并采用SDS-PAGE技術進行電泳。辣椒種子貯藏蛋白提取緩沖液為丙三醇(甘油)5 mL+SDS 1 g+溴酚藍0.1 g+巰基乙醇2.5 mL，分別用0.2 mL蒸餾水、5%氯化鈉溶液、70%乙醇、0.2% NaOH提取上清液，即為水溶蛋白提取液(代號W)、鹽溶蛋白提取液(代號S)、醇溶蛋白提取液(代號P)、堿溶蛋白提取液(代號A)。SDS-PAGE分離膠T=12.5%，4 ℃左右條件下15 mA恒流電泳，點樣量18 μL，時間約8 h。每個樣品重復3次。

1.3 數據處理與統計分析

采用“0，1”系統記錄蛋白譜帶，構建蛋白譜帶數據庫。品種間蛋白質圖譜相似系數S[15]及品種間遺傳距離GD[16]計算公式分別為

S=(品種間共有的條帶數)/(2個品種中最多的條帶數)；

GD=1-(2nxy)/(nx+ny)。

式中：nxy是2個品種間共有的條帶數；nx、ny分別是品種x、y的總條帶數。采用系統聚類最短距離法對12個辣椒品種進行聚類分析[17]，繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白質電泳檢測

由圖1、表2可知，12個辣椒品種種子貯藏蛋白質經 SDS-PAGE分析未檢測到醇溶蛋白，水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白共檢測出25條蛋白質亞基帶，有23條多態性帶，多態性率為92%，蛋白質亞基分子量分布范圍是10 093～96 232 bp，蛋白質亞基出現頻率變化幅度為0.08～1.00；點位帶編碼按分子量順序排列，堿溶蛋白、鹽溶蛋白、水溶蛋白分別檢出14、18、19條點位帶，其中有9條點位帶為3種貯藏蛋白所共有，第1、4、6點位帶為堿溶蛋白所特有，第22點位帶為鹽溶蛋白所特有，第20、21、23點位帶為水溶蛋白所特有；蛋白質亞基分子量分別為43 668 bp的第9位點、26 605 bp 的第16位點的點位帶在所有品種中都出現，是辣椒品種共同的種子貯藏蛋白質，其他出現頻度較高的點位帶有簇生椒類品種美國加州干椒王(編號5)缺少的第12點位帶、長椒類品種楚風辣椒(編號8)缺少的第10點位帶、華椒17號(編號1)缺少的第15點位帶、豐力新選8819線椒(編號3)缺少的第24點位帶；第2點位帶只在豐力新選8819線椒中出現，第5點位帶只在紫星2號(編號7)中出現，第21點位帶只在紅星2號(編號2)中出現；長椒類品種共檢測出20條蛋白質亞基帶，有17條多態性帶，多態性率為85%，都具有第9、12、16點位帶，而沒有第3、5、14、21、23點位帶；燈籠椒類品種共檢測出23條蛋白質亞基帶，有15條多態性帶，多態性率為65%，都具有第9、10、12、15、16、17、24、25點位帶，而沒有第2、7點位帶；簇生椒類品種共檢測出15條蛋白質亞基帶，沒有出現第2、3、5、7、12、18、20、21、22、25點位帶。

2.2 品種間的遺傳距離及遺傳相似系數

由表3可知，利用蛋白位點共計算得到品種間66個相似系數(S)和遺傳距離(GD)值，遺傳距離變異范圍在0.067～0.615之間，平均值為0.278 4；8819線椒(編號4)、豐力新選8819(編號3)的GD值相對最小，為0.067，華椒17(編號1)、紅星2號(編號2)的GD值相對最大，為0.615；白星2號(編號11)和紅星2號、紅妃(編號9)和紫星2號(編號7)、玉妃(編號12)和橙星2號(編號10)的GD值為0.273，處于居中水平，說明品種間有一定的遺傳差異。

2.3 聚類分析結果及親緣關系判斷

根據品種間遺傳距離的大小，采用系統聚類最短距離法逐級歸類可得到聚類圖。由圖2可知，歐氏距離平方約為5時，可將12個辣椒品種分為2大類，2大類之間的平均遺傳距離為0.313 1(平方歐式距離為9.818 7)；第Ⅰ類包括燈籠椒類品種紫星2號(編號7)、美國甜椒(編號6)、紅星2號(編號2)、橙星2號(編號10)、白星2號(編號11)和簇生椒類品種美國加州干椒王(編號5)，品種間的平均遺傳距離為0.236 7；第Ⅱ類包括長椒類品種8819線椒(編號3)、豐力新選8819(編號4)、楚風辣椒(編號8)、紅妃(編號9)、玉妃(編號12)、華椒17(編號1)，品種間的平均遺傳距離為0.250 6；最先合并在一起的有美國甜椒和紫星2號(歐氏距離平方為0.058 8)、8819線椒和豐力新選8819(歐氏距離平方為 0.059 9)、紅妃和玉妃(歐氏距離平方為0.067 8)，說明這幾對品種間具有最近的遺傳距離，親緣關系也較近；簇生椒類變種與燈籠椒類變種在歐氏距離平方為0.115 9時被合并在一起，在歐氏距離平方為9.818 7時又與長椒類變種合并在一起。聚類分析統計結果表明，簇生椒類與燈籠椒類2個變種間具有很近的遺傳距離，平均遺傳距離為0.223 8，遺傳變異程度較小，具有較緊密的親緣關系；簇生椒類與長椒類2個變種間具有較遠的遺傳距離，平均遺傳距離為0.310 3，遺傳變異程度較大，親緣關系較遠；燈籠椒類與長椒類2個變種間的遺傳距離相對最遠，平均遺傳距離為0.313 1，遺傳變異程度相對最大，親緣關系最遠。

3 結論

采用SDS-PAGE分析辣椒3個主栽變種12個品種的種子貯藏蛋白質亞基組成，未檢測到醇溶蛋白，水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白共檢測出25條蛋白質亞基帶，多態性率為92%，亞基分布范圍是10 093～96 232 bp，蛋白質亞基出現頻率變化幅度為0.08～1.00。長椒類品種共檢測出20條蛋白質亞基帶，多態性率為85%；燈籠椒類品種共檢測出23條蛋白質亞基帶，多態性率為65%；簇生椒類品種共檢測出15條蛋白質亞基帶。采用系統聚類最短距離法對12個辣椒品種進行聚類分析，12個品種被分為2大類，類內的平均遺傳距離分別為0.236 7、0.250 6，類間的平均遺傳距離為0.313 1。簇生椒類與燈籠椒類2個變種間具有很近的遺傳距離，平均遺傳距離為0.223 8，變種間的遺傳變異程度相對較小，具有較緊密的親緣關系；簇生椒類與長椒類2個變種間具有較遠的遺傳距離，平均遺傳距離為0.310 3，變種間的遺傳變異程度較大，親緣關系較遠；燈籠椒類與長椒類2個變種間的遺傳距離相對最遠，平均遺傳距離為0.313 1，變種間的遺傳變異程度相對最大，親緣關系也最遠。

表2 12個辣椒品種種子貯藏蛋白電泳出現點位帶數和出現頻度

表3 12個辣椒品種間的遺傳距離及遺傳相似系數

注：對角線右上方的數字為遺傳距離，對角線左下方的數字為相似系數。