細胞色素C氧化酶亞基Cox4的克隆及高效表達

蘇明慧， 汪一榮， 楊艷梅， 商巾杰

(南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046)

線粒體有自己的基因組，是一種半自主性的細胞器[1-2]，幾乎存在于所有真核生物中。線粒體能夠進行氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)的合成，是有氧呼吸的主要場所[3-4]，可為細胞的生命活動提供能量，被稱為細胞內的發動機[5]。同時，線粒體還參與調控細胞的信息傳遞、細胞的凋亡和細胞的分化等一系列生理過程，并且還對細胞生長和細胞周期進行調控[6]，因此，線粒體對細胞的生長至關重要[5]。氧化磷酸化是一個電子傳遞過程，依賴于線粒體的電子傳遞鏈。線粒體的電子傳遞鏈對于線粒體功能的正常發揮十分重要[7]，一旦電子傳遞鏈受損會引起很多疾病的發生[8-9]。在粟酒裂殖酵母中，電子傳遞鏈由4種復合體組成，而組成這些復合體的蛋白是由核基因組和線粒體基因組共同編碼的。細胞色素C氧化酶(復合物Ⅳ)是線粒體中電子傳遞鏈的末端酶，催化電子從細胞色素C轉移到氧[10]，核編碼的細胞色素C氧化酶亞基4(Cox4)是其中1個關鍵亞基。由此可見，在對線粒體功能進行研究時，不可避免地需要對線粒體中構成這些復合體的蛋白水平進行檢測，因此制備這些蛋白的相應抗體就顯得尤為重要。本研究主要是將粟酒裂殖酵母中構成復合體Ⅳ的細胞色素C氧化酶亞基Cox4在大腸桿菌中進行高效表達，并制備相應的抗體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381[h+，組氨酸生物合成缺陷型(his3-D1)，亮氨酸生物合成缺陷型(leu1-32)，尿嘧啶生物合成缺陷型(ura4-D18)，腺嘌呤生物合成缺陷型(ade6-M210)]，由南京師范大學微生物所實驗室保存。質粒pET-28a(+)為筆者所在實驗室保存。

1.1.2 試劑 rTaqDNA聚合酶、限制性內切酶、SolutionⅠ(貨號為6022)、蛋白marker，購自TaKaRa公司；DNA marker，購自北京全式金生物技術有限公司；DNA割膠回收試劑盒、PCR過柱純化試劑盒，購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、瓊脂粉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、山梨醇(sorbitol)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、30%丙烯酰胺和乙二胺四乙酸(EDTA)，購自索萊寶公司；酵母粉，購自OXOID公司；腺嘌呤、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸、卡那霉素(Kan)，購自Sigma公司；RNA提取試劑盒，OMEGA(貨號為R6870-00)，購自南京貝納生物技術有限公司；iScript cDNA合成試劑盒(貨號為1708890)，購自南京潤亞生物科技發展有限公司；PCR引物，由南京思普金生物工程技術服務有限公司合成；常用試劑為分析純級，購自國藥集團化學試劑有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養基 (1)LB培養基配方(100 mL)：1 g胰蛋白胨，0.5 g 酵母粉，1 g氯化鈉，在固體培養基中添加2 g瓊脂粉。(2)LB+Kan培養基：在LB培養基中添加卡那霉素至終濃度為50 mg/L。(3)YES培養基配方(100 mL)：3.0 g葡萄糖，0.5 g酵母粉，22.50 mg腺嘌呤，22.50 mg尿嘧啶，22.50 mg 亮氨酸，22.50 mg 組氨酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計 根據裂殖酵母序列信息數據庫(S.pombe_GeneDB)中登錄號為SPAC1296.02的基因序列，通過https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html預測線粒體定位序列，將線粒體定位序列去掉后，設計上下游特異性引物，在正向引物的5′端加入NdeⅠ酶切位點，在互補鏈引物的5′端加入XhoⅠ酶切位點(下劃線分別表示NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點)：正向引物：5′-GGAATTCCATATGAATGAGCAAAACGTTGTAAAAGCC-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGATGACTGTGTTCAGCGTTG GG-3′。

1.2.2 PCR片段擴增 取用YES培養過夜的粟酒裂殖酵母1.5 mL，離心收集菌體。按照OMEGA的說明書提取總RNA，然后加入反轉錄酶，以隨機六聚體為引物合成cDNA，然后以此cDNA為模板，用SPAC 1296.02的特異性引物進行擴增，擴增條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR片段用PCR過柱純化試劑盒進行純化。

1.2.3 原核表達載體pET-28a(+)/cox4p的構建 把純化后的PCR片段與pET-28a(+)載體進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化雙酶切后的產物，將兩者按合適配比加入到酶連反應體系內，16 ℃連接過夜；將酶連產物轉到大腸桿菌TOP10感受態細胞中，涂布到含有Kan抗性的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜，挑取菌落PCR呈陽性的轉化子于LB+Kan的液體培養基中，37 ℃振蕩培養10 h，通過堿裂解法提取重組質粒，經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切初步鑒定后，由南京思普金生物技術有限公司完成測序。將測序正確的重組質粒轉入到E.coliBL21感受態細胞中，得到重組表達菌株。

1.2.4 目的蛋白的表達 將重組表達菌接種到5 mL含有50 mg/L Kan的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養過夜，將重組表達菌分別轉接到2管15 mL含有50 mg/L Kan的LB液體培養基中，使其D600 nm≈0.2，37 ℃、200 r/min繼續振蕩培養至D600 nm≈0.6，此時向其中1管菌液中加入 1 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)，于37 ℃、200 r/min振蕩培養過夜。次日，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體，之后用100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為7.0)將菌體重懸，重復洗滌3次后，加入適量緩沖液[含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，簡稱PMSF)和14.3 mmol/Lβ-巰基乙醇]，將其置于冰浴中進行超聲波破碎，破碎10 s，冷卻10 s，待菌體完全破碎后，于4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，收集細胞上清，取適量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)，以分析目標產物的表達情況。

1.2.5 目的蛋白的純化 重組表達菌破碎完全后，于 16 000g、4 ℃離心30 min，將上清轉移至新的1.5 mL離心管中。向上清中加入組氨酸標簽蛋白純化試劑盒(Ni-NTA柱)，根據Ni-NTA柱的吸附度來決定上清蛋白樣品中需要加入的Ni-NTA體積。在4 ℃低溫冰箱中，用垂直混勻器勻速轉動離心管2～4 h，確保目的蛋白與Ni-NTA柱充分接觸并結合，2～4 h后，1 000g、4 ℃離心2 min，小心地將上清轉移到另1支新的1.5 mL離心管中(該上清中含有未與Ni-NTA柱結合的蛋白)，用Wash Buffer洗滌2～5次離心下來的Ni-NTA柱，保留洗液，該步的目的是去除沒有與Ni-NTA柱結合或者與Ni-NTA柱結合不牢固的蛋白。再用Elute Buffer對Ni-NTA柱進行洗脫，可將與Ni-NTA柱結合的目的蛋白洗脫下來。洗脫液的體積按照加入的Ni-NTA柱的體積換算，洗滌3次，洗滌得到的溶液主要含有所純化的目的蛋白。將目標蛋白洗脫液置于截留量為3 500 u的透析袋中對蛋白進行透析，透析液為100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為6.8)，經過3次換液后，將得到的蛋白液吸出并加入1.5 mL 離心管中，這些蛋白樣品可進行對照試驗。取適量透析后的蛋白樣品進行SDS-PAGE，以檢測目的蛋白的純化程度。

1.2.6 抗體的制備與檢測 將純化得到的蛋白作為抗原送巴傲得生物科技有限公司制備相應的抗體，然后提取粟酒裂殖酵母的線粒體[11-12]，通過Western-Blot方法檢測抗體質量。將線粒體提取液上樣于12%聚丙酰胺凝膠中，進行 SDS-PAGE，濕轉(硝酸纖維素膜，簡稱NC膜)，條件為 300 mA、100 min。用封閉液(0.137 mol/L NaCl，0.02 mol/L Tris，5%脫脂奶粉，質量濃度)封閉硝酸纖維素膜2 h。用TBST緩沖液(含0.02 mol/L Tris，0.137 mol/L NaCl，0.1% Tween 20，調節pH值至7.4)洗膜3次，按比例加入一抗，室溫孵育4 h，用TBST緩沖液洗膜3次，再按比例加入二抗，室溫避光孵育1 h，用ODYSSEY激光掃描顯示結果。

2 結果與分析

2.1 目的片段cox4的擴增

以提取的yHL6381菌株的RNA通過反轉錄得到的cDNA作為模板，通過PCR擴增目的片段cox4。目的基因cox4的堿基數為393 bp。如圖1所示，根據marker，所獲得的目的片段介于250～500 bp之間，且只有1條單一條帶，因此確定該目的片段為cox4。

2.2 重組質粒cox4-pET28a的構建及驗證

將擴增得到的cox4目的片段進行PCR過柱純化，將純化后的目的片段與載體質粒pET-28a(+)分別用NdeⅠ、XhoⅠ進行雙酶切，酶切過夜后割膠回收載體質粒片段，過柱純化目的PCR片段。將純化后的載體片段與目的PCR片段酶連，16 ℃ 反應過夜。接下來通過化學轉化法將酶連產物轉入TOP10大腸桿菌感受態細胞中，涂布于添加卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃培養12 h后，將平板取出，接種單菌落于添加卡那霉素的LB液體培養基上，于37 ℃振蕩培養 12 h 后提取重組質粒。提取的重組質粒如圖2所示。筆者選取圖2中的4號質粒進行酶切驗證。由圖3的驗證結果可以看出cox4基因的釋放片段，將4號重組質粒送至南京思普金生物科技有限公司測序。由圖4的測序結果可以看出，該片段與S.pombe_Gene DB數據庫中的序列完全一致，表明4號重組質粒的構建是成功的。

2.3 目的蛋白Cox4的表達

將上述驗證正確的重組質粒轉入BL21大腸桿菌感受態細胞中，得到帶有pET-28a(+)/cox4的重組菌株，通過IPTG誘導，使得重組質粒在細胞中表達，得到本研究所需的Cox4蛋白。筆者將經過IPTG誘導和未經過IPTG誘導的重組表達菌株通過超聲破碎處理后，進行SDS-PAGE，結果如圖5所示，在經過IPTG誘導的重組表達菌的上清組分中，可以看到1條大小為16 ku左右的蛋白條帶，與S.pombe_GeneDB上公布的Cox4蛋白大小18.16 ku相近，表明Cox4蛋白得到了表達。

2.4 目的蛋白Cox4的純化

在Cox4蛋白成功得到了表達后，筆者對表達的蛋白進行純化，通過Ni-NTA柱與目的蛋白結合，用wash buffer洗去雜蛋白與未與Ni-NTA柱結合的蛋白，最后用elute buffer將目的蛋白洗脫下來，去除鹽離子后進行SDS-PAGE，檢測蛋白的純化效果。從圖6可以看出，經過wash buffer洗脫后，去除了大部分雜蛋白，得到了純度較高的目的蛋白。

2.5 Cox4蛋白抗體的制備及檢測

筆者將純化后的Cox4蛋白樣品送至巴傲得生物科技有限公司制備抗體。抗體制備完成后，提取yHL6381的線粒體，通過免疫印記分析試驗對抗體進行檢測。如圖7所示，在線粒體提取液中，本試驗成功檢測到了Cox4蛋白且大量富集，其分子量大小與之前表達的蛋白大小是一致的，表明抗體的制備是成功的。

3 討論

在本研究中，筆者將Cox4蛋白的編碼序列去除線粒體定位序列后克隆到表達載體pET-28a(+)上，構建了pET-28a(+)/cox4重組表達質粒，因為表達載體pET28a(+)上含有T7/Lac啟動子，該啟動子在受IPTG誘導時會啟動基因的表達，因此表明重組表達質粒經過IPTG誘導，在表達型的大腸桿菌中成功表達，通過一系列優化后提高了Cox4蛋白在細胞中的表達量，得到了成功表達的Cox4蛋白。接下來將成功表達的蛋白以過Ni-NTA柱的方式進行純化，使目的蛋白與Ni-NTA柱相結合，從而去除其他雜蛋白，達到純化蛋白的目的。最后將純化的蛋白作為抗原送相關公司制備相應的抗體。通過檢測發現，本研究所制備的抗體是成功的，而且特異性較好，從而為檢測Cox4的蛋白水平研究奠定了基礎。