竹節(jié)蓼藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析

黎理 曾祥燕 謝鳳鳳 蔡毅

中圖分類號 R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1640-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.13

摘 要 目的 建立竹節(jié)蓼藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行聚類分析。方法：采用HPLC法。色譜柱為Ultimate C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.5 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為28 ℃，進樣量為10 μL。以槲皮苷為參照，繪制13批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行相似度評價，確定共有峰，并對其進行聚類分析。結(jié)果：13批藥材樣品的HPLC圖譜有12個共有峰，相似度均大于0.90；經(jīng)驗證，13批藥材樣品的HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。13批藥材樣品可聚為兩大類，S4、S6、S10聚為一類，其余聚為一類。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜和聚類分析結(jié)果可為竹節(jié)蓼藥材的質(zhì)量評價及進一步開發(fā)利用提供參考。

關鍵詞 竹節(jié)蓼；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Homalocladium platycladum， and to carry on the cluster analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Ultimate C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 360 nm， and column temperature was 28 ℃. The sample size was 10 μL. Using quercetin as reference substance， HPLC chromatograms of 13 batches of samples were determined. The similarity evaluation was carried out by using Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） to determine common peak. Cluster analysis were also conducted. RESULTS： A total of 12 common peaks were established in HPLC fingerprints of 13 batches of samples. The similarity was higher than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 13 batches of sample were in good agreement with control fingerprint. 13 batches of medicinal materials were clustered into 2 categories； S4， S6 and S10 were clustered into one category， and the rest were a category. CONCLUSIONS： Established fingerprint and cluster analysis results can provide reference for quality evaluation of H. platycladum and its exploitation and utilization.

KEYWORDS Homalocladium platycladum； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis

竹節(jié)蓼又名觀音竹、飛天蜈蚣、扁竹[1-2]，其味甘、淡，性平，歸肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、去瘀消腫之功效，主治癰瘡腫毒、跌打損傷等癥[3]。壯醫(yī)認為其味甘、酸，性微寒，具有清熱解毒、活血止血的功效，臨床主要用于扁桃體炎、支氣管炎、尿路炎癥及崩漏帶下、癰瘡腫毒、跌打損傷、蛇蟲咬傷等病癥的治療[4]。目前，竹節(jié)蓼的研究主要集中在抗腫瘤[5-7]、抗菌[8-9]作用和活性組分等方面，而在質(zhì)量評價方面研究較少。本課題組前期已通過高效液相色譜法（HPLC）測定了其中槲皮苷的含量[10]，在此基礎上，本試驗采用HPLC法對廣西5個不同產(chǎn)地13批竹節(jié)蓼藥材展開指紋圖譜研究，并進行聚類分析，以期為其質(zhì)量評價及進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G-1314A單波長檢測器、G-1311A高壓四元泵、G-1379A在線真空脫氣機、G-1316A智能化柱溫箱、G-1311A標準自動進樣器、1100 Series色譜工作站（美國Agilent公司）；FA1104型上皿天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；TGT-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試劑

槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111538-200504，供含量測定用）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

竹節(jié)蓼藥材采自廣西河池等地，詳見表1（以S13為對照藥材）。所有藥材樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院蔡毅教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，14%→14.5%A；23～55 min，14.5%→15%A；55～60 min，15%→18%A；60～68 min，18%→20%A；68～75 min，20%→23%A）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：28 ℃；進樣量：10 μL[11-12]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成槲皮苷質(zhì)量濃度為0.344 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末約1 g，精密加入 70%甲醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，用70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，以半徑5 cm、13 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以槲皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）6份，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取13批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對13批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以藥材樣品HPLC對照指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價。結(jié)果顯示，13批藥材樣品相似度為0.925～0.999，表明藥材樣品批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 13批藥材樣品有12個共有峰，通過與對照品比對指認11號峰為槲皮苷，由于其分離良好，峰面積較大，且為所有藥材樣品共有，故設定其為參照峰（S）；計算其他峰相對于11號峰的相對保留時間、相對峰面積，詳見表3、表4。

2.5 聚類分析

以13批藥材樣品12個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，應用SPSS 20.0軟件，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進行聚類分析[13-14]，結(jié)果見圖3。由圖3可知，13批藥材樣品可聚為兩大類：S4、S6、S10聚為第一類；其余聚為第二類。

3 討論

指紋圖譜研究結(jié)果表明，13批藥材樣品圖譜的相似度均大于 0.90，表明不同產(chǎn)地的竹節(jié)蓼藥材樣品質(zhì)量相對穩(wěn)定，沒有太大差異，所構建的HPLC指紋圖譜可以作為其質(zhì)量評價的依據(jù)。各共有峰相對保留時間差異較小，表明不同產(chǎn)地的藥材樣品所含化學成分基本相似；但相對峰面積差異較大，表明不同產(chǎn)地的藥材樣品中各成分間的含量比例相差較大，而這可能是由于不同的地理位置（土質(zhì)、水質(zhì)、日照）所導致的，其原因有待進一步探究[15-16]。

聚類分析結(jié)果表明，13批藥材樣品可聚為兩大類。岑溪市歸義鎮(zhèn)、河池市宜州區(qū)三合鄉(xiāng)、桂平市紫荊鎮(zhèn)、玉林市北流市六麻鎮(zhèn)所產(chǎn)竹節(jié)蓼藥材聚為一類，說明這4個產(chǎn)地藥材生長環(huán)境相近。河池市大化縣巖灘鎮(zhèn)所產(chǎn)竹節(jié)蓼藥材單獨聚為一類。

綜上所述，該研究所建指紋圖譜和聚類分析結(jié)果可為竹節(jié)蓼藥材質(zhì)量評價及進一步開發(fā)利用提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編寫委員會. 中華本草：第二冊[M].上海：上海科技出版社，1999：636.

[ 2 ] 顏萍花，唐玉榮，曾祥燕，等. 竹節(jié)蓼生藥學鑒別研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2682-2684.

[ 3 ] 《全國中草藥匯編》編寫組. 全國中草藥匯編：下冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：740.

[ 4 ] 梁啟成，鐘鳴.中國壯藥學[M].南寧：廣西民族出版社，2005：172.

[ 5 ] 方春生，楊燕軍，宋卉，等.竹節(jié)蓼不同提取部位體外抗腫瘤活性的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（12）：2865- 2868.

[ 6 ] 方春生，楊燕軍，宋卉，等. 竹節(jié)蓼石油醚部位抗腫瘤活性組分的篩選[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（7）：1071-1077.

[ 7 ] 方春生，楊燕軍，王如意，等.竹節(jié)蓼石油醚部位抗腫瘤活性組分研究及其成分GC-MS分析[J].今日藥學，2016，26（8）：538-540、544.

[ 8 ] HANIYEHK，SEYYEDMS，HUSSEIN M. Preliminary study on the antibacterial activity of some medicinal plants of Khuzestan（Iran）[J]. Asianpac J Trop Med，2010，3（3）：180.

[ 9 ] 曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].西北植物學報，2003，23（12）：2241-2247.

[10] 曾祥燕，唐玉榮，顏萍花，等. 壯藥竹節(jié)蓼的質(zhì)量標準研究[J].中國藥房，2017，28（21）：2989-2991.

[11] 印曉紅，金漢臺，譚林威，等. 不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（12）：78-80.

[12] 李志強，王靜儀. 猴耳環(huán)消炎膠囊中沒食子酸、槲皮苷的含量測定[J].廣東藥學院學報，2013，29（4）：400-402.

[13] 王元清，韓彬，向榮，等. 總量統(tǒng)計矩結(jié)合聚類分析與主成分分析評價虎杖飲片一致性與差異性[J].中草藥，2015，46（19）：2863-2869.

[14] 張洪峰，張學強，于麗霞，等. 基于HPLC指紋圖譜與聚類分析對不同產(chǎn)地連翹質(zhì)量評價[J].江蘇中醫(yī)藥，2018，50（4）：78-80.

[15] 李小亭，李瑞盈，相海恩，等. 基于 HPLC 指紋圖譜及聚類分析對不同產(chǎn)地枸杞質(zhì)量評價研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（9）：1251-1253、1261.

[16] 曹愛華. 影響山西恒山蒙古黃芪藥材中無機元素含量的環(huán)境因素分析[J].中醫(yī)學報，2018，33（1）：111-114.

（收稿日期：2017-07-23 修回日期：2017-08-12）

（編輯：張 靜）