太子參抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的活性部位篩選及作用機制研究

楊馨 張金娟 宛蕾 鄧連力 廖尚高 何迅

摘 要 目的：篩選太子參抗心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷的活性部位，并探討其作用機制。方法：太子參藥材水提物經D101大孔吸附樹脂柱以水-乙醇梯度洗脫，得水洗脫部位（Fr.A）、30%乙醇洗脫部位（Fr.B）、50%乙醇洗脫部位（Fr.C）、95%乙醇洗脫部位（Fr.D）。采用化學缺氧法以連二亞硫酸鈉復制大鼠H9c2心肌細胞H/R損傷模型，采用MTS法檢測經太子參各部位低、中、高劑量（Fr.A、Fr.B、Fr.C低、中、高劑量均分別為750、1 500、3 000 mg/L，Fr.D低、中、高劑量分別為5、10、20 mg/L）預處理后的細胞存活率，篩選活性最強部位。分別采用微板法、硫代巴比妥酸比色法、WST-1法測定經太子參活性最強部位低、中、高劑量預處理后細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性以及細胞內丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，采用蛋白質印跡法檢測細胞胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達水平。結果：經4個部位預處理后，Fr.A高劑量組，Fr.B高劑量組，Fr.C各劑量組的細胞存活率均較模型組顯著升高（P<0.05或P<0.01），且以Fr.C的活性最強。經Fr.C預處理后，各劑量組細胞培養液中LDH活性，中、高劑量組細胞內MDA含量、細胞凋亡率及Caspase-3和Bax蛋白的表達量均較模型組顯著下降（P<0.05或P<0.01）；高劑量組細胞內SOD活性以及中、高劑量組細胞Bcl-2蛋白的表達量均較模型組顯著升高（P<0.05）。結論：太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C部位均具有抗心肌細胞H/R損傷的作用，其中以Fr.C的活性最強；Fr.C抗心肌細胞H/R損傷作用可能與其改善細胞的氧化應激狀態，提高細胞清除氧自由基的能力，降低細胞脂質過氧化程度，抑制細胞凋亡，上調Bcl-2蛋白表達以及下調Caspase-3、Bax蛋白表達有關。

關鍵詞 太子參；活性部位；大鼠H9c2心肌細胞；缺氧/復氧損傷；氧化應激；細胞凋亡；胱天蛋白酶3；B細胞淋巴瘤/白血病-2；Bcl-2相關X蛋白

中圖分類號 R965.1；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1958-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.20

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the active fractions of Pseudostellaria heterophylla against myocardial hypoxia/reoxygenation （H/R） injury， and to investigate its mechanism. METHODS： The water extract of P. heterophylla was eluted with D101 macroporous adsorption resin column by water-ethanol gradient elution to obtain water elution fraction （Fr.A）， 30% ethanol eluting fraction （Fr.B）， 50% ethanol eluting fraction （Fr.C） and 95% ethanol eluting fraction （Fr.D）. H/R injury model of rat H9c2 myocardial cells was induced by chemical anoxia method with natrium hydrosulfurosum. MTS assay was used to detect survival rate of cells after pretreated with low-dose， medium-dose and high-dose of each fraction （low-dose， medium-dose and high- dose of Fr.A， Fr.B， Fr.C were 750， 1 500， 3 000 mg/L；low-dose， medium-dose and high-dose of Fr.D were 5， 10， 20 mg/L）， and the strongest active fraction of P. heterophylla was screened. After pretreated with the strongest active fraction， the activity of LDH in cell culture medium， the content of MDA and the activity of SOD in the cells were determined by microplate method， TBA method and WST-1 method， respectively. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. The expressions of Caspase-3， Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS： After the pretreatment of 4 fractions， the survival rate of cells in Fr.A high-dose group， Fr.B high-dose group and all Fr.C groups were increased significantly， compared with model group （P<0.05 or P<0.01）. The activity of Fr.C was the strongest. After pretreated with different doses of Fr.C， the activity of LDH in the culture medium of all groups， the content of MAD， apoptotic rate， the protein expression of Caspase-3 and Bax in medium-dose and high-dose groups were all decreased significantly， compared with model group （P<0.05 or P<0.01）； the activity of SOD in high-dose group， the protein expression of Bcl-2 in medium-dose and high-dose groups were increased significantly， compared with model group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The Fr.A， Fr.B and Fr.C of P. heterophylla have anti-H/R injury effects on cardiomyocytes， and the activity of Fr.C is the strongest. Anti-H/R injury of Fr.C may be related to its ability to improve oxidant stress state and scavenge oxygen free radicals， decrease the degree of lipid peroxidation， inhibit cell apoptosis， up-regulate the protein expression of Bcl-2 and down-regulate the protein expression of Caspase-3 and Bax.

KEYWORDS Pseudostellaria heterophylla； Active fraction； Rat H9c2 cardiomyocytes； Hypoxia/reoxygenation injury； Oxidant stress； Cell apoptosis； Caspase-3； Bcl-2； Bax

太子參是石竹科假繁縷屬植物孩兒參[Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，可用于治療脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥，同時也是民間用于治療心悸的重要藥材[1]。現代藥理學研究表明，太子參具有明確的抗應激、抗疲勞、降血糖、降血脂、增強免疫功能、抗心肌缺氧及改善急性心肌梗死后的慢性心力衰竭等作用[2-4]。本研究采用中藥傳統煎煮法對太子參藥材進行提取，水提物經D101大孔吸附樹脂柱以水-乙醇梯度洗脫，得到太子參不同極性部位；考察不同部位對連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）誘導的心肌細胞缺氧/復氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型的影響，篩選出活性最強的部位，并對其抗心肌細胞H/R損傷的作用機制進行初步探討，旨在為太子參的臨床應用奠定現代藥理學研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

2001HY-6003型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Elx 800UV型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Universal HoodⅡ型凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；BS223S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；MiniSpin型離心機（德國Eppendorf公司）；NovoCyte 3008型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences公司）；TS-1000型轉移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；WD-905D型水平搖床（北京市六一儀器廠）；K30型干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

太子參藥材購于貴州省凱里市黃平縣太子參栽培種植基地（批號：TZS-20140520），經貴州醫科大學藥學院龍慶德副教授鑒定為石竹科假繁縷屬植物孩兒參[P. heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的根。

D101大孔吸附樹脂（0.30～1.25 mm，天津市海光化工有限公司）；DMEM高糖培養基、DMEM無糖培養基、胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號分別為8117182、1868979、1859509）；胎牛血清（德國SeraPro公司，批號：P1701）；維生素E（純度：≥98%）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、RIPA細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為1012B036、20170227、20171018、20171011）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京雷根生物技術有限公司，批號：0424A17）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170319、20170312、20170105）；CellTiter 96? AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS）（美國Promega公司，批號：0000227663）；膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：20171017）；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體（美國BioWorld公司，批號：CC893300）；Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體（美國Proteintech公司，批號：00054598）；胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（美國Cell Signaling公司，批號：18）；兔β-肌動蛋白（β-actin）抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG07197903）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（中杉金橋生物技術有限公司，批號：133599）；免疫印跡化學發光試劑（ECL）（上海七海復泰生物科技有限公司，批號：20170906）；乙醇、Na2S2O4、二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

大鼠H9c2心肌細胞株由中國科學院上海細胞庫提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

稱取太子參藥材30 kg，用水煎煮提取2次，第1次用10倍量水浸泡過夜后加熱煎煮提取2 h，第2次用8倍量水加熱煎煮提取2 h，合并兩次提取液，濾過，濾液加熱濃縮，得水提取浸膏（得率為47.50%）。將上述浸膏用水溶解（終質量濃度為1.0 g/mL，以生藥量計），經D101大孔吸附樹脂柱，依次以水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇洗脫，收集各部分洗脫液，加熱濃縮至稠膏，得太子參水洗脫部位（Fr.A）、30%乙醇洗脫部位（Fr.B）、50%乙醇洗脫部位（Fr.C）和95%乙醇洗脫部位（Fr.D）等4個部位，分別于70 ℃下減壓濃縮、冷凍干燥，即得各部位樣品（得率分別為37.38%、3.62%、0.35%、0.02%）。精確稱取上述各部位樣品適量，用DMSO溶解，得質量濃度均為500 mg/mL的樣品溶液，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 H9c2心肌細胞H/R損傷模型的建立

將H9c2心肌細胞接種于完全培養基（DMEM高糖培養基+10%胎牛血清）中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，常規傳代。待細胞生長至對數生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，以轉速1 000 r/min離心3 min，收集細胞，用完全培養基重懸并調整細胞密度至4×104 mL-1，按100 μL/孔接種于96孔細胞培養板、2 mL/孔接種于6孔細胞培養板或5 mL/瓶接種于細胞培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h。吸棄上清液，用DMEM無糖培養基清洗2次，采用化學缺氧法[5]在培養板/瓶中加入以DMEM無糖培養基配制的終濃度為20 mmol/L的Na2S2O4溶液，繼續置于培養箱中，刺激細胞15 min使發生缺氧損傷；然后吸棄缺氧液，換用完全培養基，置于培養箱中繼續培養15 min，進行復氧。

2.3 太子參抗H9c2心肌細胞H/R損傷的活性部位篩選

取對數生長期的H9c2心肌細胞，以4×104 mL-1的密度按100 ?L/孔接種于96孔細胞培養板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，將心肌細胞隨機分為正常對照組、模型組、維生素E組以及太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D低、中、高劑量組（參照前期預試驗結果，Fr.A、Fr.B、Fr.C的低、中、高劑量分別為750、1 500、3 000 mg/L，Fr.D的低、中、高劑量分別為5、10、20 mg/L，均以各部位樣品質量計，下同），每組設6個復孔，吸棄各孔上清液，正常對照組及模型組加入完全培養基100 μL，各給藥組加入含相應劑量藥物的完全培養基100 μL，按上述條件繼續培養24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復制H/R損傷模型。復氧后，每孔加入MTS 20 μL，于培養箱中孵育3 h后，使用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率=樣品組平均OD值/正常對照組平均OD值×100%[6]。以上試驗重復3次，比較太子參不同部位對H/R損傷模型細胞存活率的影響，篩選出活性最強部位。

2.4 太子參活性最強部位對H/R損傷模型細胞培養液中LDH活性及細胞內MDA含量、SOD活性的影響

取對數生長期的H9c2心肌細胞，以4×104 mL-1的密度按2 mL/孔接種于6孔細胞培養板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，將心肌細胞隨機分為正常對照組、模型組、維生素E組和太子參活性最強部位低、中、高劑量組，每組設3個復孔。正常對照組及模型組加入完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應劑量藥物的完全培養基2 mL，按上述條件繼續培養24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復制H/R損傷模型。復氧后，各孔吸取上清液采用微板法檢測細胞培養液中LDH活性；各孔吸棄上清液后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）清洗2次，加入RIPA細胞裂解液100 μL，收集裂解后的細胞，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法檢測細胞內MDA含量，采用WST-1法檢測細胞內SOD活性。各指標均使用酶標儀檢測，并嚴格按照試劑盒說明書操作。以上試驗重復3次。

2.5 太子參活性最強部位對H/R損傷模型細胞凋亡率的影響

采用流式細胞術檢測太子參活性最強部位對H/R損傷模型細胞凋亡率的影響。取對數生長期的H9c2心肌細胞，以4×104 mL-1的密度按2 mL/孔接種于6孔細胞培養板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，將心肌細胞隨機分為正常對照組、模型組和太子參活性最強部位低、中、高劑量組，每組設3個復孔。正常對照組及模型組加入完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應劑量藥物的完全培養基2 mL，按上述條件繼續培養24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復制H/R損傷模型。復氧后，用PBS清洗2次，消化、離心收集細胞，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。以上試驗重復3次。

2.6 太子參活性最強部位對H/R損傷模型細胞凋亡調節蛋白表達的影響

采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測太子參活性最強部位對H/R損傷模型細胞凋亡調節蛋白（Caspase-3、Bcl-2、Bax）表達的影響。取對數生長期的H9c2心肌細胞，以4×104 mL-1的密度按5 mL/瓶接種于細胞培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，按照“2.5”項下方法分組。正常對照組及模型組加入完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應劑量藥物的完全培養基2 mL，按上述條件繼續培養24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復制H/R損傷模型。復氧后，用預冷的PBS清洗2次，加入含1% PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液100 μL，冰浴30 min，將細胞刮下，收集裂解后的細胞液，于4 ℃下以轉速12 000 r/min離心10 min，取上清液采用二喹啉甲酸法（BCA）測定蛋白濃度[7]。經蛋白上樣緩沖液稀釋后，用100 ℃沸水將蛋白變性后置于-80 ℃保存，備用。每組取蛋白20 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以5%胎牛血清蛋白室溫封閉2 h，加入相應一抗[Caspase-3（1 ∶ 1 000）、Bcl-2（1 ∶ 1 000）、Bax（1 ∶ 5 000）、β-actin（1 ∶ 5 000）]，在室溫下振搖2 h后，于4 ℃孵育過夜，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min，加入二抗[HRP標記的山羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000）]，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL顯色后，置于凝膠成像分析儀上成像并用Image Lab 3.0軟件分析。以相應蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的相對表達量。以上試驗重復3次。

2.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或Dunnetts t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 太子參抗H9c2心肌細胞H/R損傷的活性部位篩選結果

與正常對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，維生素E組，Fr.A高劑量組，Fr.B高劑量組，Fr.C各劑量組的細胞存活率均顯著升高，且Fr.C的抗細胞損傷作用呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；而Fr.A低、中劑量組，Fr.B低、中劑量組，Fr.D各劑量組的細胞存活率與模型組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。這提示Fr.C是太子參抗H9c2心肌細胞H/R損傷的活性最強部位，詳見表1。

3.2 Fr.C對H9c2心肌細胞H/R損傷后LDH、MDA、SOD水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞培養液中LDH活性和細胞內MDA含量均顯著升高，而細胞內SOD活性顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01），提示細胞明顯受損。與模型組比較，維生素E組和Fr.C各劑量組細胞培養液中LDH活性均顯著降低，且呈一定的劑量依賴性，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；Fr.C中、高劑量組細胞內MDA含量均顯著降低，Fr.C高劑量組細胞內SOD活性顯著上升，差異均有統計學意義（P<0.05）。這提示Fr.C能減輕H/R損傷后H9c2心肌細胞的受損程度，對其具有一定的保護作用，詳見表2。

3.3 Fr.C對H9c2心肌細胞H/R損傷后細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，模型組的細胞凋亡率顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，Fr.C中、高劑量組的細胞凋亡率均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；而Fr.C低劑量組的細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），詳見圖1、表3。

3.4 Fr.C對H9c2心肌細胞H/R損傷后Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞H/R損傷后Caspase-3、Bax蛋白表達量均顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，Fr.C中、高劑量組細胞Caspase-3、Bax蛋白表達量均顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；而Fr.C低劑量組細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達量雖有變化，但差異均無統計學意義（P>0.05）。這表明Fr.C中、高劑量能下調Caspase-3、Bax蛋白表達，并上調Bcl-2蛋白表達，詳見圖2、表3。

4 討論

缺血性心臟病（Ischemic heart disease，IHD）是一類嚴重的心血管系統疾病，是目前導致患者死亡和心功能衰竭的主要原因[8]。針對IHD所采取的主要治療方法再灌注療法（如藥物療法、冠狀動脈搭橋術、經皮冠狀動脈介入術等）可能會加重患者心肌細胞結構及功能的損壞程度，從而導致心肌缺血/再灌注損傷（Myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）[9]。由于MIRI存在著復雜的致病因素，故目前尚無療效可靠的防治藥物[10]。因此，開發更加安全、有效的抗MIRI藥物對防治心肌缺血性疾病具有重要的臨床價值。

心肌缺血性損傷主要是供給心肌的氧減少，氧自由基清除系統功能減弱，生成系統活性卻增強；而心肌再灌注損傷主要是當恢復氧氣供應時，氧自由基急劇生成并大量堆積，從而造成心肌細胞結構損傷和功能代謝障礙，故MIRI的病因可主要歸結為心肌細胞的H/R損傷[11-12]。為此，本研究采用化學缺氧法以終濃度為20 mmol/L的Na2S2O4溶液誘導心肌細胞損傷，復制H/R（即缺血/再灌注）損傷模型，從分子水平上初步探討了太子參不同極性部位對H/R損傷心肌細胞的保護作用及可能機制。

已有研究表明，維生素E是一種高效的自由基清除劑和脂質過氧化作用阻斷劑，能夠有效地保護心血管系統，降低心血管疾病的發病率[13]，對MIRI具有一定的療效[14]，并具有明顯的抗細胞凋亡能力[15]，故本研究以維生素E作為陽性對照藥物。同時，本研究參照前期預試驗安全濃度范圍設定了太子參不同部位的低、中、高劑量。本研究結果表明，太子參4個部位分別作用于H/R損傷模型24 h后，Fr.A、Fr.B、Fr.C均可不同程度地提高心肌細胞的存活率，其中Fr.C的作用最為顯著。這提示Fr.A、Fr.B、Fr.C對Na2S2O4誘導H/R損傷的H9c2心肌細胞均具有一定的保護作用，且Fr.C的保護作用最強，可能與該部位富含苷類成分有關[3]。隨后，本研究以活性最強的Fr.C為對象，初步探討了太子參抗H9c2心肌細胞H/R損傷的作用機制。

目前，MIRI的機制研究包括氧自由基、炎癥反應、鈣超載、能量代謝障礙、血管內皮細胞及細胞凋亡等。細胞內自由基的大量產生以及氧自由基清除能力的下降是引發MIRI的主要原因，因此在治療MIRI時，應提高機體抗氧化物酶的活性，增加清除氧自由基的能力，以減輕氧自由基對心肌細胞的損傷[16-17]。LDH是一種糖酵解酶，在正常生理條件下，很少從細胞質中釋放；而當細胞受到損傷時，LDH便會從細胞質中釋放出來，其滲出量的多少可間接反映細胞膜的損傷程度[18]。MDA是細胞內脂質的過氧化產物，其能與蛋白質、氨基酸或者其他生物大分子相互作用，最終改變磷脂結構，使生物膜受到嚴重損害，其含量可間接反映細胞脂質過氧化的程度[19]。通常情況下，內源性抗氧化物酶（SOD等）是防止氧化應激產生損傷的第一道防線，這類酶通過清除過量的氧自由基使機體處于平衡狀態，其活性的高低可反映機體清除氧自由基的能力，并間接反映機體對氧化損傷細胞的保護程度[20]。本研究結果顯示，在太子參Fr.C預作用于心肌細胞H/R損傷模型24 h后，其低、中、高劑量組細胞培養液中LDH活性以及中、高劑量組細胞內MDA含量均顯著降低，高劑量組細胞內SOD活性顯著上升，提示Fr.C能有效抑制H/R損傷細胞釋放LDH，并降低細胞內MDA含量、提高細胞內SOD活性。這表明Fr.C能提高細胞清除氧自由基的能力，減輕細胞膜等受自由基攻擊后的損傷，降低H/R損傷致心肌細胞脂質過氧化的程度，從而有效保護心肌細胞，這種保護作用可能與該部位能夠有效抑制心肌細胞受損過程中的脂質過氧化有關[19]。

細胞凋亡發生在許多疾病的生理與病理過程中，隨著心血管病學研究的不斷深入，研究者發現MIRI致心肌細胞死亡有兩種機制，即壞死和凋亡，而后者是引發心血管系統疾病的重要原因[21]。心肌再灌注雖然恢復了血流，但同時也可能加速受損心肌細胞的凋亡過程，故細胞凋亡在MIRI的病理過程中發揮著重要作用[22]。細胞凋亡的發生受細胞內凋亡調節蛋白的調控，其分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類，細胞凋亡的發生是這兩者平衡失調的結果。Bcl-2家族成員的構成比例是細胞凋亡調控的關鍵因素，Bcl-2有抗凋亡作用，而Bax有促凋亡作用，Bcl-2/Bax是啟動細胞凋亡的“凋亡開關”，Bcl-2可與過表達的Bax形成異二聚體，抑制細胞凋亡，在抗細胞凋亡中發揮關鍵作用[23]。細胞凋亡的執行者及啟動者是Caspase，其中Caspase-3不僅是Caspase家族的關鍵凋亡蛋白酶，同時也是細胞凋亡的核心標志物之一[24]。在外界刺激或Caspase-3等因子活化時，Bax從細胞質轉入線粒體或細胞核內，導致促凋亡因子與抗凋亡因子失衡，從而誘導細胞凋亡[25]。本研究結果顯示，太子參Fr.C預作用于心肌細胞H/R損傷模型24 h后，其中、高劑量組細胞凋亡率較模型組顯著下降，且Caspase-3、Bax蛋白表達量顯著下降，Bcl-2蛋白表達量顯著上升，提示其可有效抑制細胞凋亡，防止心肌細胞數目減少，維持或改善心功能。這表明Fr.C對H9c2心肌細胞H/R損傷的保護可能與其抗凋亡作用有關。

綜上所述，太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C均具有一定的抗心肌細胞H/R損傷的作用，其中以Fr.C的活性最強。上述作用可能與其可改善細胞的氧化應激狀態，提高細胞清除氧自由基的能力，降低心肌細胞受損過程中的脂質過氧化程度，抑制細胞凋亡，上調Bcl-2蛋白表達及下調Caspase-3、Bax蛋白表達有關。本研究可為了解太子參在心肌細胞H/R損傷過程中的保護作用及其機制提供參考。

參考文獻

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（收稿日期：2018-01-13 修回日期：2018-05-13）

（編輯：張元媛）