聲光可調—近紅外光譜法快速判斷精芪雙參膠囊的混合終點及測定黃芪甲苷的含量

蘇婷 姜文月 李亞東 任緒華 馬子君 齊美欣 崔憲利 高陸

中圖分類號 R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1616-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.08

摘 要 目的：建立快速判斷精芪雙參膠囊的混合終點及測定黃芪甲苷含量的方法。方法：采用聲光可調-近紅外光譜法（AOTF-NIR）結合主成分分析法及移動窗標準偏差法判斷混合終點；以一階導數法聯合平滑濾波系數法預處理混合終點樣品光譜，并采用偏最小二乘法建立混合終點樣品中黃芪甲苷含量的定量模型，并采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD）測定混合終點樣品中黃芪甲苷的含量以進行驗證。結果：混合終點樣品中黃芪甲苷含量測定方法學經驗證符合要求。混合物料樣品在混合30 min時可達到混合終點，NIR預測結果與HPLC-ELSD法實測的混合終點結果一致；定量模型的主成分維數為9，決定系數為0.954 9，校正均方根偏差為0.039 2，預測均方根偏差為0.042 6；黃芪甲苷含量的NIR預測平均值為11.74 mg/g，HPLC-ELSD法實測平均值為11.38 mg/g，平均偏差為3.16%。結論：AOTF-NIR法可快速判斷精芪雙參膠囊的混合終點，并能夠快速測定混合終點樣品中黃芪甲苷的含量，可提高其混合過程的質量控制水平，縮短混合周期。

關鍵詞 聲光可調-近紅外光譜法；移動窗標準偏差法；一階導數法；平滑濾波系數法；偏最小二乘法；精芪雙參膠囊；混合終點；黃芪甲苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for rapid judgement of blending endpoint of Jingqi shuangshen capsules and content determination of astragaloside Ⅳ. METHODS： AOTF-NIR combined with principal component analysis and Moving Block Standard Deviation method was used to identify the blending endpoint. First derivative combined with savitzky-golay filter method were used to spectrum pretreatment. The partial least square method was used to establish quantitative analysis model of the content of astragaloside Ⅳin mixed endpoint sample. The content of astragaloside Ⅳ in mixed endpoint sample was determined by HPLC-ELSD to validate the model. RESULTS： Methodology validation of content determination of astragaloside Ⅳ in mixed material sample and mixed endpoint sample was in line with the requirements. NIR monitoring results showed that the product reached the blending endpoint after 30 min. The results of NIR monitoring were generally consistent with the results of HPLC-ELSD. The principal component dimension of the quantitative model was 9； determination coefficients was 0.954 9； Root Mean Square of Calibration of the model was 0.039 2； Root Mean Square Error of Prediction of the model was 0.042 6. Predicted average value of astragaloside Ⅳ by NIR was 11.74 mg/g， and measured average value of astragaloside Ⅳ by HPLC-ELSD was 11.38 mg/g； average deviation was 3.16%. CONCLUSIONS： AOTF-NIR can rapidly judge the blending endpoint sample of Jingqi shuangshen capsules， rapidly determine the content of astragalosideⅣin mixed endpoint material， improve the quality control level of blending process and shorten blending cycle.

KEYWORDS AOTF-NIR； Moving Block Standard Deviation method； First derivative method； Savitzky-golay filter method； Partial least square method； Jingqi shuangshen capsules； Blending endpoint； Astragaloside Ⅳ

精芪雙參膠囊具有補氣養陰、活血化瘀、養心安神的功效，適用于心腦血管疾病相關的心悸氣短、頭暈頭痛、倦怠乏力、耳鳴眼花、肢體麻木、失眠健忘等癥。該藥由黃芪、丹參、人參、黃精等中藥材組成，生產過程中由藥材細粉及提取物等物料混合入藥，而混合過程是該藥填充前的重要環節，混合均勻度可直接影響產品質量的均一性[1]。傳統的混合均勻度檢測耗時長，難以實時反映混合過程動態變化及有效終點[2]。近紅外光譜（NIR）檢測技術是近年來發展迅速的一種綠色分析技術[3]，第5代聲光可調（AOTF）-NIR儀具有體積小、便于攜帶、性能穩定、環境適應性強等特點[4]，在中藥固體制劑混合過程中的成功應用已有先例[5]，但目前AOTF-NIR技術在混合過程中的應用大多為混合終點的判斷[6]，而同步定量建模及檢測指標成分含量鮮有報道。混合工藝是精芪雙參膠囊填充膠囊前最后一個生產環節，采用傳統質量控制手段需要等待檢驗結果出具后才可進行膠囊填充，工時較長，特別是黃芪甲苷含量測定樣品前處理過程操作煩瑣[7]，需要回流提取2次后萃取4次，再以高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD）檢測，周期較長。為此，本研究采用AOTF-NIR法實時考察了該藥混合過程及混合均勻度[8]，以判斷其混合終點[9]，并建立了快速測定混合終點指標成分黃芪甲苷含量的模型[10]，實現了該藥混合過程的在線質量控制，旨在為提高該藥成品質量均一性、穩定性提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LUMINAR 4030型自由空間式在線AOTF-NIR儀，包括SNAP光譜分析軟件、CAMO化學計量學軟件、Unscrambler光譜建模軟件（美國Brimrose公司）；HF-2000型方錐混合機（常州越強干燥設備有限公司）；RIGOL L-3000型HPLC儀，包括L-3530 ELSD檢測器、RIGOL色譜工作站（蘇州普源精電科技有限公司）；ME204E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑

精芪雙參膠囊混合終點樣品（吉林長白山藥業集團股份有限公司，批號：160203、160204、160301、160321、160322、160401、160402、160403、160601、160603、160604、160607、160701、160702、160703、160704、160705、160706、160707、160708、160709、160711、160901、160903、160904、160905、160906、160907、160908、160909、160910、161003、161004、161103、161102、161107、161110、161209）；黃芪、丹參、人參、黃精藥材及提取物均由吉林長白山藥業集團股份有限公司提供；黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201515，純度：98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷含量的HPLC-ELSD法測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（36 ∶ 64，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測器：ELSD；氣體流量：2.7 L/min；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.493 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取混合終點樣品約2.5 g，精密稱定，用含2%氫氧化鉀的甲醇溶液加熱回流2次（時間分別為1、0.5 h），每次50 mL，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL微熱使溶解，以三氯甲烷-正丁醇（2 ∶ 1，V/V）的混合溶液提取4次，每次30 mL，分取下層溶液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，后轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 專屬性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，供試品色譜圖中，在與黃芪甲苷對照品保留時間相應的位置上，出現相同的色譜峰，該峰分離度大于1.5；理論板數按黃芪甲苷峰計應不低于6 000，說明本色譜條件專屬性良好。

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液5、10、15、20、25 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量的對數（x，μg）為橫坐標、峰面積的對數（y）為縱坐標進行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程y=1.40x+3.05（r=0.999 3）。結果表明，黃芪甲苷進樣量的線性范圍為2.465～12.325 μg。

2.1.6 方法學考察 按相關標準進行方法學試驗。結果表明，精密度、穩定性、重復性試驗中黃芪甲苷峰面積的RSD均小于2.00%，表明儀器精密度、溶液穩定性、方法重復性均較好。黃芪甲苷加樣回收率范圍為98.63%～103.02%，RSD為1.96%（n=6）。

2.1.7 耐用性試驗 取混合終點樣品（批號：160203）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，分別考察不同色譜柱[Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ACE-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、柱溫（±5 ℃）、流動相比例（±2%）、流速（±0.2 mL/min）條件下黃芪甲苷的峰面積，各條件平行測定2次。結果，不同條件下黃芪甲苷峰面積的RSD均小于1.00%，表明本色譜條件在一定波動范圍內的耐用性良好。

2.1.8 樣品含量測定 取30批混合終點樣品各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表1。

2.2 混合終點判斷模型的建立與驗證

2.2.1 光譜采集 將物料裝入方錐混合機的混合罐中，將NIR儀通過接口安裝到混合灌進料口，混合開始后儀器隨著混合罐一起轉動（電機轉速為10 r/min）[9]。當物料粉末完全覆蓋采樣窗口，即采樣窗口朝上（180°）時觸發NIR儀采集光譜。掃描范圍：1 100～2 300 nm；掃描次數：200次；分辨率：8 cm-1。

2.2.2 模型建立 利用SNAP光譜分析軟件，采用主成分分析法（PCA）結合移動窗標準偏差法（MBSD）建立在線監測物料粉末的混合均勻度的模型，以判斷混合終點。在MBSD計算過程中，選取n條連續記錄的光譜作為一個區塊，按公式計算光譜中各個波長處吸光度的標準偏差（Si）和波長范圍內對應的標準偏差的均值（S）。計算公式：

區塊每移動一個時間點，即剔除所選光譜中時間最早的一條光譜，并補充一條新的光譜重新計算Si和S，以此類推。當Si趨于0且逐漸穩定時，認為混合過程完成，達到混合終點。按“2.2.1”項下光譜采集方法，跟蹤3批（批號：160203、160204、160301）樣品的生產過程，并在線采集這3批樣品混合過程中混合物料的光譜，采用MBSD法建立混合均勻度在線光譜比對模型進行監測。3批混合物料的MBSD法在線監測結果見圖2。

由圖2可知，混合開始時物料的MBSD波動劇烈，25 min后MBSD逐漸降低，30 min后MBSD趨于平穩，55 min后MBSD再次出現波動。提示混合30～50 min時物料混合均勻度較穩定，在30 min時已混合均勻。

2.2.3 模型驗證 混合過程中，混合罐每旋轉5 min停止運行1次，以取樣探針分別于混合物料的上、下、左、右、前、中、后等7個位點采集混合物料樣品。當混合物料樣品經液相分析顯示相同時間各位點混合物料樣品間黃芪甲苷含量的RSD均小于3.00%時，提示混合物料樣品已混合均勻[9]。不同時間各位點混合物料樣品中黃芪甲苷含量的RSD見表2。

結果顯示，混合0 min時，黃芪甲苷含量的RSD較大，隨著混合時間的延長，黃芪甲苷含量的RSD逐漸減少并趨于平穩；混合25 min時，黃芪甲苷含量的RSD接近3.00%，30 min后RSD<3.00%；繼續混合至55 min時，黃芪甲苷含量的RSD有回升趨勢。說明物料混合30～50 min時的混合均勻度較穩定，30 min時可達到混合終點。NIR法預測的混合終點與HPLC-ELSD法實測的混合終點結果一致，提示所建立的混合終點判斷模型預測準確性較高。

2.3 定量模型的建立與驗證

2.3.1 光譜采集 按“2.2.1”項下光譜采集方法進行操作，并根據物料觸發NIR儀采集光譜的時間，挑選出30批混合終點樣品對應的光譜，其光譜疊加圖見圖3。

2.3.2 光譜預處理方法的選擇 在建立模型前，需要消除噪音和基線漂移等影響，采用SNAP光譜分析軟件中的光譜處理程序對原始光譜進行預處理。常用的預處理方法有多元散射校正法（MSC）、標準歸一化法（SNV）、一階導數法（FD）、二階導數法（SD）、平滑濾波系數法（SG）等。對各批混合終點樣品的近紅外原始光譜進行預處理，比較各處理方法下的黃芪甲苷含量指標的校正集內部交叉驗證相關系數（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）及預測均方根偏差（RMSEP）[10]，詳見表3。

運用Unscrambler光譜建模軟件，以偏最小二乘法（PLS）建立NIR定量分析模型[11]。選擇R2、RMSEC、RMSEP為評價指標，綜合評價不同模型的準確性與適用性。其中，R2越接近1，說明NIR預測值與HPLC-ELSD法實測值相關性越好；RMSEC、RMSEP越小，說明所建定量分析模型適用性越強、預測效果越好。結果表明，采用FD+SG法預處理光譜可有效消除顏色差別等因素引起的噪音和基線漂移。預處理后的近紅外光譜見圖4。

2.3.3 定量模型建立 采用PLS法[12]將含量測定結果與預處理光譜進行關聯，利用CAMO化學計量學軟件[13]，以交叉-驗證法建立定量模型，并采用光譜影響值和化學值誤差等統計量檢驗并剔除NIR預測值與HPLC-ELSD法實測值中的異常值。NIR定量模型顯示，黃芪甲苷定量模型的主成分維數為9，R2為0.954 9，RMSEC為0.039 2，RMSEP為0.042 6。提示，NIR預測值與HPLC-ELSD法實測值的相關性良好，表明模型性能較好。黃芪甲苷含量近紅外模型見圖5。

2.3.4 定量模型驗證 在線監測5批（批號：161103、161102、161107、161101、161209）混合終點樣品的混合過程，記錄NIR預測的混合終點及黃芪甲苷含量結果，并采集混合罐進料口混合物料樣品，采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量，計算黃芪甲苷含量NIR預測值與HPLC-ELSD法實測值的偏差，利用定量模型對5批混合終點樣品進行分析，以驗證定量模型預測的準確性，結果見表4[注：偏差=│實測值-預測值│/實測值×100%]。

3 討論

本研究在定量模型驗證中采用了HPLC-ELSD法測定精芪雙參膠囊中黃芪甲苷的含量，經方法學驗證，各考察項均符合要求。本研究首次建立了精芪雙參膠囊混合過程的NIR在線監測模型，結果表明采用AOTF-NIR法與HPLC-ELSD法判定樣品的混合終點結果一致，且無需校正，可用于實時分析物料的混合均勻度，分析結果準確度高，檢測速度快。通過NIR在線監測，測得混合30 min后MBSD較低且趨于平穩，達到混合終點。該結果對合理調整工作進程、節省工時、降低成本具有重要意義。

在混合終點監測的基礎上，本研究進行了混合終點樣品中黃芪甲苷含量的快速測定，結果表明，混合終點樣品中黃芪甲苷含量的NIR在線預測模型準確性較高，可用于混合終點樣品的含量預測，其拓展了自由空間式在線AOTF-NIR儀的使用功能。

綜上所述，AOTF-NIR法可快速判斷精芪雙參膠囊的混合終點，并能夠快速測定混合終點樣品中黃芪甲苷的含量，可提高其混合過程的質量控制水平，縮短混合周期。

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（收稿日期：2017-11-13 修回日期：2018-05-05）

（編輯：陳 宏）