Box—Behnken響應面法優化蓽茇總生物堿的提取工藝研究

楊家強 車萬莉 彭紅艷 王維

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1802-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.18

摘 要 目的：優化蓽茇總生物堿的提取工藝，為蓽茇的深入開發和綜合利用提供參考。方法：以總生物堿（指標性成分為胡椒堿）的提取率為考察指標，藥材粉碎度、液料比、提取時間、提取次數為考察因素，采用單因素試驗和Box-Behnken響應面法優化蓽茇總生物堿的提取工藝，并進行3次（蓽茇用量分別為1.00、10.00、100.00 g）驗證試驗。結果：最優提取工藝為粉碎度90目，加入32倍量的無水乙醇提取3次，每次提取170 min。最優工藝條件下，在蓽茇用量為1.00、10.00、100.00 g時蓽茇總生物堿的提取率分別為5.015、5.028、5.041 mg/g，與預測值5.025 mg/g的相對誤差分別為0.20%、0.06%、0.26%，差異較小。結論：本研究優選的蓽茇總生物堿的提取工藝合理、穩定、可行。

關鍵詞 蓽茇；總生物堿；Box-Behnken響應面法；提取率；提取工藝

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of total alkaloids from Piper longum， and to provide reference for deep development and comprehensive utilization of P. longum. METHODS： With the extraction rates of total alkaloids （the target component for piperine） as reference index， using comminution degree of medicinal materials， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times as factors， single factor test and Box-Behnken response surface methodology were adopted to optimize the extraction technology of total alkaloids from P. longum. The validation tests were conducted for 3 times （the amounts of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g）. RESULTS： The optimal extraction technology was that comminution degree of 90 mesh， 32-fold absolute ethanol， extracting for 3 times， lasting for 170 min each time. Under optimal technology， the extraction rates of total alkaloids from P. longum were 5.015， 5.028， 5.041 mg/g when the amount of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g； relative errors of them to predicted value 5.025 mg/g were 0.20%， 0.06%， 0.26%， respectively. There was small difference. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology of total alkaloids of P. longum is reasonable， stable and feasible.

KEYWORDS Piper longum； Total alkaloids； Box-Behnken response surface methodology； Extraction rate； Extraction technology

蓽茇為胡椒科植物蓽茇（Piper longum L.）的干燥近成熟或成熟果穗，味辛、熱，具有溫中散寒、下氣止痛之功效，用于脘腹冷痛、嘔吐、寒凝氣滯、胸痹心痛、頭痛、牙痛等[1]。現代研究表明，蓽茇具有抗氧化、抗血小板集聚、抗高血脂和抗菌等多種作用[2-4]。蓽茇中生物堿種類較多、含量高，具有多種生物活性，在醫藥和農業中的應用均較廣泛[5]。研究顯示，蓽茇總生物堿對多種實體腫瘤和血液病均有抑制作用，具有很好的清除自由基能力[6]；對6-羥基多巴胺誘導的帕金森病模型大鼠的黑質細胞具有保護作用[7]；此外，還具有殺蟲、殺螨作用[8]等。Box-Behnken響應面法是一種優化工藝條件的有效方法，已被廣泛地用于多因素的試驗優化[9-10]。本研究擬采用Box-Behnken響應面法優化蓽茇總生物堿的提取工藝，為蓽茇的質量控制以及對其深入開發和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS224S電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；510酸度計（北京中西遠大科技有限公司）；XS-04B多功能粉碎機（東莞市隆鑫機電設備有限公司）；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

蓽茇藥材（遵義中藥材公司，批號：160056，由遵義醫學院楊建文主任藥師鑒定為真品）；胡椒堿對照品（上海雅吉生物科技有限公司，批號：16041311，純度：99.99%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 蓽茇總生物堿的提取

取蓽茇藥材切成小段，粉碎機粉碎，過篩，取一定量的粉末，置于圓底燒瓶中，再加入無水乙醇，加熱回流提取，過濾，合并濾液，濃縮，收集備用。

2.2 蓽茇總生物堿的含量測定

采用酸性染料比色法[11]測定蓽茇總生物堿的含量。精密稱取0.010 0 g胡椒堿對照品，置于25 mL棕色量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取適量上述溶液，再用無水乙醇分別稀釋制成質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L的對照品溶液。精密量取0.5 mL上述各對照品溶液，置于6個分液漏斗中，分別加入6.0 mL溴百里香酚藍溶液和pH 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液4.0 mL，搖勻；加入20 mL二氯甲烷，振搖，靜置30 min。然后在418 nm波長處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標（y）、質量濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，得到標準曲線的方程為y=49.694x-0.021 3（r2=0.999 2），結果表明，胡椒堿質量濃度在0.053～20.65 mg/L范圍內線性關系良好。根據標準曲線計算蓽茇總生物堿的提取率：總生物堿提取率=CV1V2/V3W×100%（C=測量液總生物堿的濃度；V1=測量液定容的體積；V2=提取液定容的體積；V3=測量時量取的體積；W=樣品的質量）。

2.3 單因素試驗考察

在對中藥材生物堿提取的過程中，藥材粉碎度、溶劑種類、提取的料液比、提取時間以及提取次數等因素對提取率有著重要影響[12-13]。因此，在本工藝優化試驗中，筆者選擇如下因素進行考察。

2.3.1 藥材粉碎度 取蓽茇粉末，過20、40、60、80、100目標準篩，分別精密稱取不同粉碎度樣品1.00 g，置于圓底燒瓶中，在室溫下用10倍量體積的無水乙醇浸提2 h，計算出不同粉碎度樣品中總生物堿的提取率。結果顯示，過20、40、60、80、100目標準篩樣品中蓽茇總生物堿的提取率分別為2.92、3.12、3.21、3.30、3.22 mg/g，故確定80目蓽茇細粉為最優提取粉碎度。

2.3.2 液料比 精密稱取6份蓽茇細粉（過80目標準篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，依次加入10、20、30、40、50、60倍量的無水乙醇，浸潤30 min后，加熱回流提取2 h，計算不同液料比下樣品總生物堿的提取率。結果顯示，加入10、20、30、40、50、60倍量的無水乙醇提取后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.30、3.41、3.59、3.43、3.42、3.31 mg/g，故確定液料比30 ∶ 1為最優提取條件。

2.3.3 提取時間 精密稱取6份蓽茇細粉（過80目標準篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入30倍量的無水乙醇，浸潤30 min后，分別加熱回流提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，計算不同提取時間下樣品總生物堿的提取率。結果顯示，加熱回流0.5、1、2、3、4、5 h后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.05、3.26、3.59、3.75、3.66、3.58 mg/g，故確定加熱回流提取3 h為最優提取時間。

2.3.4 提取次數 精密稱取4份的蓽茇細粉（過80目標準篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入30倍量的無水乙醇，浸潤30 min后，分別回流提取1、2、3、4次，每次提取時間為3 h，計算出不同提取次數下樣品總生物堿的提取率。結果顯示，提取1、2、3、4次后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.75、4.16、4.93、4.96 mg/g，故確定最優提取次數為3次。

2.4 響應面試驗優化

2.4.1 Box-Behnken試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選擇粉碎度（X1）、液料比（X2）、提取時間（X3）、提取次數（X4）作為考察因素，采用四因素三水平的響應曲面法進行試驗。因素與水平見表1，Box-Behnken試驗設計與結果見表2。

2.4.2 模型建立與方差分析 通過Design Expert 8.06軟件對上述試驗結果進行多元回歸擬合，得到回歸方程：總生物堿提取率（Y）=5.01+0.22X1-0.26X2-0.28X3-0.15X4-0.18X12-0.43X22-0.31X32-0.23X42+0.29X1X2+0.17X1X3-0.15X1X4+0.17X2X3+0.19X2X4+0.27X3X4（R2=0.991 3）。方差分析結果見表3。

由表3可知，蓽茇總生物堿提取模型的P<0.05，表明該回歸模型是顯著的，用該模型對蓽茇總生物堿的提取工藝進行分析試驗是合理的。根據表3中F值的大小，推測影響本試驗提取率大小的因素為X1>X2>X3>X4。從表3中還可以看出，二次項X22、X32、X42對響應值的影響顯著（P<0.05）。

2.4.3 響應面分析 用Design Expert 8.06軟件分析，得出影響蓽茇總生物堿提取率的各因素交互作用的響應面圖，結果見圖1。

由圖1可知，隨著液料比的增大，蓽茇總生物堿的提取率先呈緩慢上升趨勢，達到最大值后開始下降；隨著提取時間的增加，能增大蓽茇總生物堿的提取率，但是時間過長其提取率有所下降；隨著提取次數的增加，提取率有先上升后下降的趨勢；從圖中也可知，粉碎度的改變對提取率的影響較大，隨著粉碎度的增加，提取率逐漸增大，當達到一定程度時，提取率上升緩慢；同時，隨著液料比的增大，蓽茇總生物堿的提取率也呈現先緩慢上升然后降低的趨勢，兩者交互影響較顯著。

根據上述所得結果，由Design Expert 8.06軟件分析得出：在穩定狀態下蓽茇提取量的最大值為5.021 mg/g，相對應的粉碎度90.26目、液料比32.16 ∶ 1、提取時間2.86 h，提取次數2.91次。以實際操作的方便考慮，將其修正為粉碎度90目，液料比32 ∶ 1，提取時間170 min，提取次數3次。

2.4.4 驗證試驗 根據優化提取工藝，分別取蓽茇樣品1.00、10.00和100.00 g進行3次平行試驗，結果蓽茇總生物堿的平均提取率分別為5.015、5.028和5.041 mg/g（RSD分別為1.5%、2.2%、2.7%，n=3），與預測值5.025 mg/g的相對誤差分別為0.20%、0.06%、0.26%。3次平行試驗的提取率差異較小，說明該工藝穩定可靠。

3 討論

中藥蓽茇的化學成分中含有大量的生物堿，而胡椒堿作為其中主要存在的生物堿[14]，含量高、結構明確、性質穩定、有明顯的紫外吸收，故本研究以胡椒堿作為指標性成分考察蓽茇總生物堿的提取工藝，具有可行性和科學性。

為了優化蓽茇總生物堿的提取工藝，筆者通過預試驗先后考察了提取溶劑的種類、藥材粉碎度、提取時間、提取次數、提取溫度、溶劑的濃度、液料比等對總生物堿提取率的影響。在溶劑方面，筆者首先分別選擇了無水乙醇、無水乙酸乙酯和水為溶劑，結果以無水乙醇為溶劑提取效果最好；接著，筆者又分別考察了無水乙醇、90%乙醇和80%乙醇的提取效果，結果隨著乙醇體積分數的降低，蓽茇總生物堿提取率明顯減小，故在本研究中選用無水乙醇為提取溶劑。在提取溫度方面，預試驗中筆者分別設置提取溫度為50、60、70、80 ℃，結果發現，當溫度為50、60 ℃時，總生物堿的提取率很低，而將溫度從70 ℃升高至80 ℃時，總生物堿的提取率變化不大，故在本研究中未將提取溫度作為考察因素。而同時進行的預試驗結果顯示，藥材粉碎度、提取時間、液料比、提取次數的改變對蓽茇總生物堿提取率的影響較大。因此，在本研究中筆者選取上述4個因素對蓽茇總生物堿的提取工藝進行優化。

本研究結果顯示，將蓽撥粉碎太細時總生物堿的提取率會下降，這可能是因為過細的粉末使得其吸附作用增強，導致擴散速度而降低，最后影響其浸出效果；也可能是因為粉碎太細使得藥材的細胞破裂，致使大量不溶物增加。而較粗的粉末也會導致提取率較低，這可能是與溶劑的接觸面小，影響擴散速度和浸出效果有關。蓽茇的化學成分中包含的胡椒堿、蓽茇明寧堿等生物堿的化學性質比較穩定，故較長的提取時間能獲得較高的提取率。合適的料液比能有效除去中藥蓽茇中的脂質、鞣質等雜質，有助于提高總生物堿的提取率。隨著提取次數的增加，在一定次數范圍內能提高其提取率，但是隨著提取次數的繼續增加，溶液中殘留的生物堿含量降低，由于提取時間的延長，可能破壞酰胺類生物堿等化學成分的結構，最終導致提取率降低。

綜上所述，筆者采用Box-Behnken響應面法優化了蓽茇中總生物堿提取工藝，且優化后的提取工藝合理可行。

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（收稿日期：2018-01-19 修回日期：2018-04-10）

（編輯：林 靜）