大黃素和黃芩苷聯用對急性胰腺炎模型大鼠Akt/Nrf2通路的影響研究

李慧艷 張超 張松 徐灝 劉潔 李菲 楊琦

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1754-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.07

摘 要 目的：研究大黃素和黃芩苷聯用對急性胰腺炎（AP）模型大鼠的改善作用和機制。方法：將70只大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃素組（250 mg/kg）、黃芩苷組（250 mg/kg）、奧曲肽組（陽性對照，10 μg/kg）、N-乙酰半胱氨酸組（陽性對照，180 mg/kg）和大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷），每組10只。除假手術組外，其余各組大鼠均復制AP模型，造模成功后靜脈注射給予相應藥物。在給藥后3、6、12、24 h，測定各組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶水平；在給藥24 h后，檢測大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、髓過氧化物酶（MPO）和胰腺組織中半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase-3）水平，并采用Western blot法檢測各組大鼠胰腺組織中蛋白激酶B（Akt）磷酸化和核因子E2相關因子2 （Nrf2）蛋白表達水平。另取40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）和大黃素+黃芩苷+LY294002（Akt特異性抑制劑）組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷+100 mg/kg LY294002），每組10只，進行機制驗證實驗。同法造模、給藥，24 h后檢測大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平。結果：與假手術組比較，從給藥后3 h開始，模型組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶水平即顯著升高（P<0.01）；給藥后24 h，大鼠血清中MDA、MPO和胰腺組織中Caspase-3水平均顯著升高（P<0.01），血清中SOD、GSH和胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，從給藥后6 h開始，各給藥組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著降低（P<0.01）；給藥24 h后，各組大鼠血清中MDA、MPO和胰腺組織中Caspase-3水平均顯著降低（P<0.01），血清中SOD、GSH和胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。機制驗證實驗中，與大黃素+黃芩苷組比較，大黃素+黃芩苷+LY294002組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。結論：大黃素和黃芩苷聯用對AP模型大鼠具有一定的改善作用，其機制可能與促進Akt磷酸化以上調Nrf2蛋白表達，并促進其下游抗氧化酶的表達，從而降低體內氧化應激水平有關。

關鍵詞 大黃素；黃芩苷；急性胰腺炎；氧化應激；蛋白激酶B；核因子E2相關因子2；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of emodin combined with baicalin on acute pancreatitis （AP） model rats and its possible mechanism. METHODS： A total of 70 rats were randomly divided into sham operation group， model group， emodin group （250 mg/kg）， baicalin group （250 mg/kg）， octreotide group （positive control， 10 μg/kg）， N-acetyl cysteine group （positive control， 180 mg/kg）， emodin+baicalin group （125 mg/kg emodin+125 mg/kg baicalin）， with 10 rats in each group. Except for sham operation group， AP model was induced in each group. After modeling， relevant medicines were given intravenously. After 3， 6， 12， 24 h of medication， the serum levels of amylase and lipase were determined. After 24 h medication， serum levels of SOD， MDA， GSH， MPO and level of Caspase-3 in pancreatic tissue were determined. The levels of Akt phosphorylation and expression of Nrf2 protein in pancreatic tissue of rats were determined by Western blot assay. Another 40 ratss were randomly divided into sham operatsion group， model group， emodin+baicalin group （125 mg/kg emodin+125 mg/kg baicalin） and emodin+baicalin+LY294002 （Akt specific inhibitor） group （125 mg/kg emedin+125 mg/kg baicalin+100 mg/kg LY294002）， with 10 ratss in each group. Mechanism verification test was performed. The modeling and medication method of those groups were same to above groups， 24 h later. The level of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were determined in pancreatic tissue of rats. RESULTS： Compared with sham operation group， the serum levels of amylase， lipase of rats were significuntly increased in model group after 3 h of medication （P<0.01）； levels of MDA， MPO in serum and Caspase-3 in pancreatic tissue were significantly increased in model group （P<0.01）， while the levels of SOD， GSH in serum and the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were decreased significantly in pancreatic tissue of rats（P<0.01）. Compared with model group， the serum levels of amylase and lipase were decreased significantly in administration groups after 6 h of medication （P<0.01）. After 24 h medication， the levels of MDA， MPO in serum and Caspase-3 in pancreatic tissue were decreased significantly （P<0.01）， while the levels of SOD， GSH in serum and the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were increased significantly in pancreatic tissue of rats （P<0.01）. In mechanism verification test， compared with emodin+baicalin group， the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein in pancreatic tissue were decreased significantly in emodin+baicalin+LY294002 group （P<0.01）. CONCLUSIONS： Emodin combined with baicalin shows certain improvement effect on AP rats， the mechanism is that the level of Akt phosphorylation is promoted so as to up-regulate the expression of Nrf2 protein， and the expression of antioxidant enzyme is promoted so as to reduce the level of oxidative stress in AP model rats.

KEYWORDS Emodin； Baicalin； Acute pancretitis； Oxidative stress； Akt； Nrf2； Rats

急性胰腺炎（Acute pancretitis，AP）是指胰腺內的胰酶被激活后，引發胰腺組織發生自身消化反應，從而造成的胰腺損傷，特別是重癥急性胰腺炎（SAP），病情嚴重而且發展較快，還會伴發其他器官的損傷，死亡率高達20%～30%[1]。近年來的文獻研究表明，氧化應激在AP的發生和發展過程中扮演著極其重要的角色，而且還與胰腺以外其他器官的損傷有著密切關系[2]。當體內氧化自由基水平增加，抗氧化酶活性降低時，會引起炎癥反應和微循環障礙，從而引起細胞凋亡和組織損傷，最終導致胰腺和其他器官的損傷[3]。因此，抗氧化損傷對治療胰腺炎及其伴發的其他器官損傷具有積極作用。蛋白激酶B（Akt）/核因子E2相關因子2（Nrf2）是體內重要的內源性抗氧化信號通路，可調節組織內抗氧化酶的表達而發揮抗氧化作用。有研究發現，通過調控Akt/Nrf2通路，可發揮抗氧化和抗炎作用，從而治療小鼠AP及其并發癥[4-5]。可見，尋找可以激活Akt/Nrf2信號通路的藥物，將對治療AP有很大的幫助。

大黃和黃芩聯合應用治療AP見于多個中藥組方，比如清胰湯、大承氣湯、大黃柴苓湯、胰炎靈顆粒等，應用廣泛，療效確切[6]。其中大黃素是中藥大黃的主要成分之一，可以通過抑制胰酶生成、抗炎、抗氧化和調節免疫功能等機制發揮治療AP作用[7]。黃芪中的黃芩苷對AP大鼠組織中炎癥因子具有很好的抑制作用[8]，還可通過增加腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）和血紅素氧合酶1（HO-1）的蛋白含量改善AP大鼠伴發的腎損傷[9]。可見，大黃素和黃芩苷對AP均有一定的改善作用，那么兩者合用是否有增效作用還未見文獻報道。由于常用于治療胰腺的中藥方劑清胰湯中大黃和黃芩的比例為 1 ∶ 1，且在預實驗中筆者發現以此比例配伍應用效果較好，故本研究擬在AP大鼠模型基礎上，聯合給予大黃素和黃芩苷（1 ∶ 1），研究二者的增效作用及作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Selectra-E全自動生化分析儀（荷蘭威圖科學公司）；Infinite F50全自動酶標儀（瑞士Tecan公司）；蛋白凝膠電泳系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷標準品（批號：20151017，純度：>98%）、大黃素標準品（批號：20151103，純度：>98%）均購自西安賽德有機科技有限責任公司；牛磺膽酸鈉（批號：86349，純度：98%）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，批號：A750，純度：>99%）、Akt特異性抑制劑LY294002（批號：M2128，純度：98%）均購自美國Sigma公司；醋酸奧曲肽注射液（瑞士諾華制藥有限公司，批號：H20150948，規格：0.1 mg/mL）；SOD（批號：20170105）、丙二醛（MDA，批號：20170213）、谷胱甘肽（GSH，批號：20170122）、髓過氧化物酶（MPO，批號：20170204）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3，批號：20170123）測定試劑盒均購自南京建成生物有限公司；血清淀粉酶測定試劑盒（批號：20170315）、血清脂肪酶測定試劑盒（批號：20170311）均購自溫州東歐公司；兔抗大鼠Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、Nrf2和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.3 動物

健康Wistar大鼠110只，清潔級，♂，6周齡，體質量190～230 g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心[動物生產合格證號：SCKX（軍）2007-007]。大鼠購入后采用滅菌標準飼料喂養，期間自由飲水，室溫控制在20～25 ℃，濕度控制在40%～70%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠適應性喂養1周后隨機分為假手術組、模型組、大黃素組（250 mg/kg）、黃芩苷組（250 mg/kg）、大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）、NAC組（180 mg/kg）和奧曲肽組（10 μg/kg），每組10只，進行藥效及機制考察實驗。為了驗證蛋白分子之間的作用，重新取40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃素+黃芩苷組（250 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）和大黃素+黃芩苷+LY294002組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷+100 mg/kg LY294002），進行機制驗證實驗（檢測大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達水平）。NAC和奧曲肽給藥劑量根據臨床使用劑量折算而來，大黃素和黃芩苷根據臨床常用劑量設定，比例根據前期預實驗結果確定。模型組和給藥組大鼠均采用50 g/L的牛磺膽酸鈉經十二指腸行膽胰管逆行進行加壓注射，注射速度為0.1 mL/min，制備大鼠AP模型[9]；假手術組大鼠開腹后僅翻動胰腺，隨即關腹。給藥組大鼠造模后立即靜脈注射給予相應劑量的藥物；假手術組和模型組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

2.2 樣本采集與處理

分別在大鼠給藥后3、6、12、24 h抽取血液標本，于EP管中靜置，然后以1 500×g低溫離心 10 min，吸取血清并分裝于凍存管中，放-80 ℃冰箱凍存，用于測定血清中淀粉酶、脂肪酶及其他生化指標；末次取血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，取胰腺組織測定其中蛋白表達情況。

2.3 血清中淀粉酶和脂肪酶水平的測定

按照測試盒方法進行操作，檢測各組大鼠給藥后3、6、12、24 h血清中淀粉酶和脂肪酶水平，測定儀器為全自動血生化分析儀。

2.4 血清中SOD、MDA、GSH和MPO水平的測定

給藥24 h后，各組大鼠血清中SOD水平采用黃嘌呤氧化酶法測定，GSH水平采用分光光度法測定，MDA水平采用硫代巴比妥酸法測定，MPO水平采用酶化學法測定，各指標測定步驟嚴格按照相應試劑盒說明書操作完成。

2.5 胰腺組織中Caspase-3水平的測定

取50 mg胰腺組織，加入冰組織裂解液500 μL，組織研磨儀研磨5 min至無組織塊，冰浴10 min，然后以 10 000×g離心10 min，收集上清，置于-80 ℃冰箱中凍存。用檢測緩沖液按1 ∶ 10的比例稀釋，采用比色法測定各組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，檢測波長為450 nm。

2.6 胰腺組織中 Akt磷酸化及Nrf2 蛋白表達水平的測定

采用Western blot法測定除奧曲肽和NAC組外其余各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達水平。取胰腺組織，與組織蛋白提取液一起在組織勻漿機上勻漿，然后10 000×g離心10 min，收集組織上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）法對上清液中蛋白定量，然后將蛋白置于-70 ℃冰箱中保存，備用。蛋白在100 ℃條件下變性后，取等量蛋白（25 μg）上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干轉膜法轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉后，用相應一抗 （1 ∶ 1 000）在4 ℃下孵育，振蕩過夜；TBST液漂洗3遍，羊抗兔二抗（1 ∶ 5 000）孵育1 h；TBST液漂洗3遍，采用化學發光超敏顯色試劑盒顯影。實驗結果采用Quantity one軟件進行分析，以目的蛋白和內參（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平，以p-Akt/Akt比值表示Akt的磷酸化水平。將假手術組比值設置為1，以其他組與假手術組的比值計算其相對值。

2.7 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計學軟件對結果進行分析。實驗數據以x±s表示，采用單因素方差分析和LSD檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清中淀粉酶和脂肪酶水平的測定結果

從給藥后3 h開始，模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著高于假手術組（P<0.01），而且隨著給藥時間的延長血清中淀粉酶和脂肪酶水平逐漸升高。大黃素和黃芩苷單獨給藥時，均可以降低模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，但在給藥后3 h時與模型組比較差異并沒有統計學意義（P>0.05），從給藥后6 h開始差異具有統計學意義（P<0.01）。而大黃素和黃芩苷聯合給藥時，可顯著降低模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，且從給藥后3 h開始與模型組比較差異即具有統計學意義（P<0.01）；而且與相同時間點的單用大黃素和黃芩苷比較，聯用效果更好，且與奧曲肽和NAC效果相當。給藥不同時間后各組大鼠血清中淀粉酶水平的測定結果見表1，脂肪酶水平的測定結果見表2。

3.2 血清中MDA、MPO、SOD和GSH水平的測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清中MDA、MPO水平顯著增加（P<0.01），而SOD、GSH水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠血清中MDA、MPO水平均顯著降低（P<0.01），SOD和GSH水平均顯著升高（P<0.01），且大黃素+黃芩苷組大鼠血清中SOD和GSH水平顯著低于大黃素組和黃芩苷組（P<0.01）。各組大鼠血清中MDA、MPO、SOD、GSH水平的測定結果見表3。

3.3 胰腺組織中Caspase-3水平的測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，大黃素+黃芩苷組、奧曲肽組和NAC組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著降低（P<0.01），并且大黃素+黃芩苷組顯著低于大黃素組和黃芩苷組（P<0.01），與奧曲肽組和NAC組效果相當（P>0.05）。各組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平的測定結果見表4。

3.4 胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平的測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），且大黃素+黃芩苷組顯著低于大黃素組、黃芩苷組（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達的電泳圖見圖1，測定結果見表5。

3.5 機制驗證結果

與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，大黃素+黃芩苷組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與大黃素+黃芩苷組比較，大黃素+黃芩苷+LY294002組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表6。

4 討論

奧曲肽是臨床常用的治療胰腺炎的藥物，具有較好的治療效果；NAC對大鼠胰腺炎具有很好的治療效果，而且其主要通過抗氧化發揮的作用，因此本研究選擇這兩個藥物為陽性對照藥物。有研究發現，血清淀粉酶和血清脂肪酶聯合檢測對診斷AP患者具有重要意義[10-11]。在本研究中，模型組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著升高，符合AP模型特征，提示造模成功。大黃素和黃芩苷單獨給藥后從6 h開始，對模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平有一定的抑制作用；而二者聯用時，在3 h時即可顯著抑制模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，表明兩者聯用效果優于單用。

氧自由基生成過多和抗氧化酶系統的破壞被認為是導致AP發生時細胞損傷的關鍵因素，同時也是導致全身性氧化應激的主要因素[12]。為了反映藥物對體內氧化應激的作用，本研究測定了血清中氧化指標MDA、MPO、SOD和GSH的水平。結果發現，模型組大鼠血清中MDA和MPO水平較假手術組均顯著升高（P<0.01），表明造模后大鼠處于較高的氧化應激水平。大黃素和黃芩苷單獨給藥后，血清中MPO和MDA水平有所降低，而二者聯用后大鼠血清中MPO和MDA水平進一步降低，表明大黃素和黃芩苷聯用能夠有效促進抗氧化酶表達，且效果優于單用。

體內過量的氧自由基和炎癥因子會誘導細胞凋亡，凋亡是一種機體自我保護調節機制，但過量的凋亡會造成組織壞死，引起組織損傷[13]。Caspase家族在介導氧化應激和凋亡信號中具有重要作用，其中Caspase-3在介導細胞凋亡過程中扮演著重要角色[14]。在本研究結果中，模型組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著升高，表明凋亡被過度激活；大黃素和黃芩苷單獨給藥后大鼠胰腺組織中Caspase-3水平被不同程度地抑制，而二者聯用時則進一步降低了Caspase-3水平，發揮出更好的抗凋亡作用。

Nrf2蛋白是各種細胞內對抗氧化應激的重要核轉錄蛋白，機體在受到刺激或者某些激活劑作用時，Nrf2被激活后轉移入核，通過抗氧化反應元件（ARE）調控一系列抗氧酶表達，增加細胞對抗氧化應激的能力[15]。當Nrf2缺失或者激活有障礙時，細胞對刺激源的敏感性增加，會引起炎癥、凋亡或癌變等反應[16]。在本研究中，模型組大鼠胰腺組織中Nrf2蛋白表達水平顯著低于假手術組，表明Nrf2的激活受阻。當給予大黃素和黃芩苷后，大鼠胰腺組織中Nrf2蛋白表達水平顯著升高，而兩者聯用時Nrf2蛋白表達水平進一步升高，效果優于單用。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其磷酸化后被激活，可以調控下游靶基因表達，與細胞增殖、分化和凋亡都有著密切的聯系[16]。同時，Akt激活后可以促進Nrf2蛋白表達，進而促進抗氧化酶表達。在本研究中，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化水平降低，而給藥后Akt磷酸化水平顯著升高，表明大黃素和黃芩苷聯用可以激活Akt信號通路。LY294002是一種Akt的特異性抑制劑，與藥物同時給予大鼠后發現，其可阻斷Akt的激活，Nrf2蛋白表達量也顯著降低，表明大黃素和黃芩苷聯用通過Akt通路調節Nrf2蛋白表達，從而發揮治療AP作用。

綜上所述，大黃素和黃芩苷聯用對AP的改善效果優于大黃素和黃芩苷單用，大黃素和黃芩苷聯用可通過Akt通路調控Nrf2蛋白表達，促進其下游抗氧化酶的表達，從而降低體內氧化應激水平，最終發揮治療AP作用。本研究結果為臨床開發相關制劑，證明大黃素和黃芩苷的聯用效果提供了實驗基礎。

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（收稿日期：2017-11-09 修回日期：2018-03-01）

（編輯：林 靜）