加參方浸膏對H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用研究

郝軒軒 王新陸 崔琳 王幼平 李彬 謝世陽 高原 朱明軍

摘 要 目的：觀察加參方浸膏對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法：采用MTT法，考察400、200、100、50、25 μmol/L的H2O2與3.0、1.8、0.9、0.3、0.1 mg/mL加參方浸膏對H9c2心肌細(xì)胞活性的影響。將H9c2心肌細(xì)胞分為正常組、模型組、加參方組，除正常組細(xì)胞加入相應(yīng)培養(yǎng)基外，模型組、加參方組細(xì)胞均采用50 μmol/L H2O2處理以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，加參方組在模型組基礎(chǔ)上加入0.3 mg/mL加參方浸膏干預(yù)處理。采用DAPI染色法，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定細(xì)胞中胱天蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，Western Blot法測定Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：50 μmol/L為H2O2最適造模濃度，0.3 mg/mL為加參方浸膏最適藥物干預(yù)濃度。與模型組比較，加參方組細(xì)胞的形態(tài)改善，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：加參方浸膏對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中Caspase-3、Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 加參方；浸膏；過氧化氫；H9c2心肌細(xì)胞；凋亡；胱天蛋白酶3；Bax；Bcl-2

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1898-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.07

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the intervention effects of Jiashen formula extractum on hydrogen peroxide（H2O2）-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes， and to investigate its mechanism. METHODS： MTT assay was used to investigate the effects of 400， 200， 100， 50， 25 μmol/L H2O2 and 3.0， 1.8， 0.9， 0.3， 0.1 mg/mL Jiashen formula extractum on the activity of H9c2 cardiomyocytes. H9c2 cardiomyocytes were divided into normal group， model group and Jiashen formula group. Model group and Jiashen formula group were given 50 μmol/L H2O2 to induce oxidative stress injury except that normal group was cultured with corresponding culture medium. Jiashen formula group was given 0.3 mg/mL Jiashen formula extractum for intervention on the basis of model group. Cell morphology was observed by fluorescence microscope through DAPI dye. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. Fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect mRNA expression levels of Caspase-3， Bax and Bcl-2 in cells； Western Blot assay was used to determine the protein expression levels of Caspase-3， Bax and Bcl-2. RESULTS： 50 μmol/L was the most suitable modeling concentration of H2O2； 0.3 mg/mL was the most suitable intervention concentration of Jiashen formula extractum. Compared with model group， cells in Jiashen formula extractum group were significantly improved in morphology and reduced in apoptosis rate； mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax were significantly reduced， and those of Bcl-2 were significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： Jiashen formula extractum shows significant inhibitory effect on H2O2-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes， the mechanism of which may be associated with down-regulation of Caspase-3 and Bax expression and up-regulation of Bcl-2 expression in cardiomyocytes.

KEYWORDS Jiashen formula； Extractum； Hydrogen peroxide； H9c2 cardiomyocytes； Apoptosis； Caspase-3； Bax； Bcl-2

心力衰竭是各種病因的心臟病的終末階段，是心臟病患者死亡的重要原因，而心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常重要的作用[1]。多種因素都可能引起細(xì)胞凋亡，其中活性氧（ROS）誘導(dǎo)在心肌細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域越來越受關(guān)注。正常情況下，心肌細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的少量ROS會被機(jī)體有效清除，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下會發(fā)生ROS的過度積累，這可能引起細(xì)胞能量代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而引起心功能的下降和失代償，最終發(fā)生心力衰竭[2-4]。因此，如何清除心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS，減少其對細(xì)胞的損害作用，成為心力衰竭治療領(lǐng)域的研究熱點。研究表明，中醫(yī)藥在抑制心肌細(xì)胞凋亡方面具有獨特功效，如補(bǔ)陽還五湯[5]、通塞脈湯[6]等。加參方是經(jīng)張伯禮院士臨床實踐證實能有效治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗方。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加參方浸膏可減少心肌梗死模型大鼠的梗死面積，改善心功能，保護(hù)心肌細(xì)胞[7]；可通過TGF-β1/Smad信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖[8]。另有研究表明，加參方浸膏可調(diào)節(jié)慢性心力衰竭模型大鼠的內(nèi)分泌系統(tǒng)并改善其微循環(huán)[9]。基于此，本實驗采用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷建立細(xì)胞凋亡模型，考察加參方浸膏對H2O2致心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用及其作用機(jī)制，以期為加參方相關(guān)制劑的后續(xù)研發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ROC-3000TVBB型CO2培養(yǎng)箱（美國Revco公司）；LDZ5-2型低速自動平衡離心機(jī)（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司）；Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；XK96-3型微量振蕩器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；WD-9405B型水平搖床（北京市六一儀器廠）；SpectraMax M3型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；DMI3006型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；小型蛋白垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

加參方浸膏（組方為香加皮、黃芪、三七、丹參、桂枝、益母草、桑白皮、澤瀉、葶藶子等，1 g浸膏相當(dāng)于9.515 g生藥）由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究中心提供。

胎牛血清（FBS，以色列BI公司，批號：04-001-1A）；DMEM高糖培養(yǎng)基（含雙抗）、0.25%胰蛋白酶、MTT粉末、即用型DAPI（4′ ，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：12100-500、T1320、B0016K012500、c0065）；H2O2溶液（10 mol/L）、GAPDH內(nèi)參抗體（美國Sigma公司，批號：MKBS8306V、G8795）；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（內(nèi)含1×binding buffer、AnnexinⅤ、碘化丙啶等，美國BD公司，批號：6119909）；Trizol試劑（美國Ambion Life Technologies公司，批號：103105）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：c28025-032、c11744- 100）；胱天蛋白酶3（Caspase-3）兔多克隆抗體、Bax兔多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號：9662、2772、2876）；牛抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根過氧化酶標(biāo)記物（HRP）、牛抗鼠IgG-HRP（美國Santa Cruz公司，批號：sc-2370、sc-2380）；RIPA細(xì)胞裂解液（美國Thermo公司，批號：OC183166）；磷酸鹽緩沖液（PBS，本實驗室自制，pH 7.2～7.4）；其他試劑均為市售分析純，水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

H9c2大鼠心肌細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心提供。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 加參方浸膏藥液 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，稱取加參方浸膏干粉0.1 g，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL助溶，再加入含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)液”）10 mL混勻，經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌，制成10 mg/mL的藥物原液，4 ℃保存。臨用時，以培養(yǎng)液稀釋制成3.0、1.8、0.9、0.3、0.1 mg/mL系列質(zhì)量濃度的藥液。

2.1.2 H2O2溶液 取H2O2溶液（10 mol/L）適量，以培養(yǎng)液稀釋制成400、200、100、50、25 μmol/L系列濃度的溶液，即用即配。

2.1.3 MTT溶液 稱取MTT粉末50 mg，加入PBS 10 mL溶解，經(jīng)0.22 μm濾器濾過，于4 ℃下避光保存。臨用時，以DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋制成0.5 mg/mL的溶液。

2.2 造模濃度/給藥濃度篩選

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，采用MTT法篩選H2O2（模型誘導(dǎo)劑）的造模濃度和加參方浸膏（干預(yù)藥物）的給藥濃度。

2.2.1 H2O2造模濃度篩選 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：取H9c2心肌細(xì)胞，以培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下（以下同）常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個/孔接種于96孔板中，共接種6組，每組6個復(fù)孔，分別加入培養(yǎng)液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)90%后棄上清液。（2）H2O2造模濃度篩選：上述各組孔中分別加入400、200、100、50、25、0（空白）μmol/L的H2O2溶液100 μL[加入0（空白）μmol/L H2O2溶液者作為空白對照組]，常規(guī)培養(yǎng)6 h以建立心肌細(xì)胞凋亡模型；棄上清液，加入MTT溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)2 h；棄上清液，加入DMSO 100 μL，室溫震蕩10 min后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度（OD）值，以考察細(xì)胞活性。

2.2.2 加參方浸膏給藥濃度篩選 按照“2.2.1”項下方法培養(yǎng)細(xì)胞并分組。在各孔中分別加入3.0、1.8、0.9、0.3、0.1、0（空白）mg/mL的加參方浸膏藥液各100 μL[加入0（空白）mg/mL加參方浸膏藥液者作為空白對照組]，常規(guī)培養(yǎng)24 h；然后按“2.2.1”項下“棄上清液……于490 nm波長處測定OD值”步驟操作，以考察細(xì)胞活性。

2.3 加參方浸膏對H2O2致凋亡模型細(xì)胞的干預(yù)作用考察

2.3.1 加參方浸膏對心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 由于凋亡細(xì)胞的膜通透性增加， DAPI對其穿透力增強(qiáng)，因此在凋亡細(xì)胞中DAPI會產(chǎn)生亮藍(lán)色熒光，有別于正常細(xì)胞的微弱藍(lán)色熒光[12]。基于此，本試驗采用DAPI染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：按照“2.2.1”項下方法接種細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)90%后棄上清液，分別設(shè)為正常組、模型組、加參方組。其中，正常組加入培養(yǎng)液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μL；模型組加入50 μmol/L H2O2溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μL；加參方組加入50 μmol/L H2O2溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入0.3 mg/mL加參方浸膏藥液100 μL。3組細(xì)胞均繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在室溫下以PBS沖洗2次，加入4%多聚甲醛1 mL固定10 min；洗去多聚甲醛，加入少量DAPI溶液覆蓋樣品，室溫下染色10 min；以水洗凈，晾干，熒光顯微鏡下（激發(fā)波長：360 nm）觀察，鏡下亮藍(lán)色細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2.3.2 加參方浸膏對心肌細(xì)胞凋亡的影響 按“2.3.1”項下方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；收集細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液；1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌，收集細(xì)胞；加入1×bin- ding buffer、AnnexinⅤ（10 g/mL）和碘化丙啶（10 g/mL）后培養(yǎng)15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，以FlowJo 7.6軟件分析凋亡細(xì)胞的分布情況。

2.3.3 加參方浸膏對心肌細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法。按“2.3.1”項下方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；參照文獻(xiàn)[8]，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA用于合成cDNA；以GAPDH為內(nèi)參基因，分別對Caspase-3、Bax、Bcl-2進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線（65～95 ℃），采用2-ΔΔCT相對定量法[13]計算mRNA表達(dá)水平。RT-PCR引物序列見表1。

2.3.4 加參方浸膏對心肌細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 采用Western Blot法。按“2.3.1”項下方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；參照文獻(xiàn)[8]方法裂解細(xì)胞后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗GAPDH抗體（1 ∶ 3 000）、Caspase-3兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、Bax兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、Bcl-2兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000），4 ℃冷藏過夜；TBST緩沖液洗膜，分別加入二抗牛抗兔IgG-HRP（1 ∶ 2 000）、牛抗鼠 IgG-HRP（1 ∶ 3 000），37 ℃恒溫?fù)u床孵育1 h，TBST緩沖液洗膜；采用化學(xué)發(fā)光法曝光，以ImageJ 1.8.0軟件測得蛋白條帶相對灰度值，用以表示蛋白表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

各項試驗均平行操作3次。試驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 H2O2造模濃度篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞活性逐漸下降并呈濃度依賴性。與空白對照組比較，當(dāng)H2O2濃度為50～400 μmol/L時，細(xì)胞OD值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明其對細(xì)胞的毒性顯著增強(qiáng)、細(xì)胞活性顯著下降。綜合考慮，選擇對細(xì)胞損傷程度適中的50 μmol/L H2O2建立細(xì)胞凋亡模型（該濃度組細(xì)胞活性約為空白對照組的一半）。

3.2 加參方浸膏給藥濃度篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著加參方浸膏質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞活性逐漸下降并呈濃度依賴性。與空白對照組比較，當(dāng)加參方浸膏質(zhì)量濃度為0.1～0.3 mg/mL時，細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明其對細(xì)胞無明顯毒性；當(dāng)加參方浸膏質(zhì)量濃度為0.9～3.0 mg/mL時，細(xì)胞OD值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明其對細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生明顯的毒性作用。考慮到藥物濃度過高也會對細(xì)胞造成損傷，因此選擇無細(xì)胞毒性的最高質(zhì)量濃度的0.3 mg/mL加參方浸膏進(jìn)行后續(xù)試驗。

3.3 加參方浸膏對心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果

熒光顯微鏡下可見，正常組細(xì)胞核形態(tài)呈圓形或橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，呈現(xiàn)較弱的藍(lán)色熒光；模型組有大量呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞邊緣不規(guī)整；加參方組的凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組少，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)較弱的藍(lán)色熒光，詳見圖1（圖中，細(xì)箭頭所指為正常細(xì)胞，粗箭頭所指為凋亡細(xì)胞）。

3.4 加參方浸膏對心肌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞流式細(xì)胞圖見圖2，凋亡率比較見圖3。

3.5 加參方浸膏對心肌細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細(xì)胞中Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，加參方浸膏可通過下調(diào)Caspase-3、Bax，上調(diào)Bcl-2的mRNA表達(dá)水平起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。各組細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平比較見圖4。

3.6 加參方浸膏對心肌細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，加參方浸膏可通過下調(diào)Caspase-3、Bax，上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。各組細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)水平比較見圖6。

4 討論

心力衰竭是一種常見的心血管疾病，是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。發(fā)生心力衰竭時，心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心臟電活動和心肌收縮功能嚴(yán)重紊亂，促使心力衰竭進(jìn)一步發(fā)展[1]。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡是治療心力衰竭的重要策略。加參方是經(jīng)張伯禮院士臨床驗證治療慢性心力衰竭有效的經(jīng)驗方，方中以香加皮、黃芪補(bǔ)益心氣，丹參、三七活血化瘀，桂枝溫通心脈，澤瀉、葶藶子、益母草、桑白皮化濕利水，諸藥配合以達(dá)益氣活血、溫陽利水之效[14-15]。本課題組采用H2O2建立H9c2心肌細(xì)胞凋亡模型，考察加參方浸膏對細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制。

H9c2心肌細(xì)胞屬于永生大鼠心肌細(xì)胞系，已被證明其形態(tài)特征與原代心肌細(xì)胞相似，且仍保留成年大鼠心肌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特征[16]，因此被廣泛用于試驗研究。

H2O2作為細(xì)胞系或原代細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其使用劑量在不同研究中各有差異[17-18]。本課題組考察了不同濃度H2O2對心肌細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，H2O2濃度越高，心肌細(xì)胞活性越低；當(dāng)H2O2濃度在50～400 μmol/L時，細(xì)胞活性較正常組細(xì)胞顯著降低，表明H2O2對細(xì)胞的毒性呈明顯的濃度依賴性。綜合考慮，選擇對細(xì)胞損傷程度適中的50 μmol/L H2O2建立細(xì)胞凋亡模型。

對加參方浸膏給藥濃度的篩選結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞比較，加參方浸膏質(zhì)量濃度為0.1～0.3 mg/mL時細(xì)胞活性未見顯著下降，表明這一質(zhì)量濃度范圍的加參方浸膏無明顯細(xì)胞毒性作用；而隨著加參方浸膏質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加（0.9～3.0 mg/mL），細(xì)胞活性顯著下降，呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。為避免藥物本身對細(xì)胞造成的損傷，同時也為確保藥效足夠，故選擇無細(xì)胞毒性的最高質(zhì)量濃度的0.3 mg/mL加參方浸膏進(jìn)行后續(xù)試驗。

對正常細(xì)胞、經(jīng)50 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞以及經(jīng)0.3 mg/mL加參方浸膏+50 μmol/L H2O2共同處理的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和凋亡率測定，結(jié)果顯示，加參方浸膏能顯著抑制細(xì)胞凋亡，具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族包含20余種Bcl-2的同源蛋白，可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白：典型的抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-W等主要存在于線粒體外膜，具有抗細(xì)胞凋亡活性；典型的促凋亡蛋白如Bax，其與Bcl-2具有高度的氨基酸序列同源性，在正常細(xì)胞中以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)受到相關(guān)的凋亡信號刺激時會轉(zhuǎn)移到線粒體上，改變線粒體膜電位與線粒體通透性，促進(jìn)凋亡活性物質(zhì)細(xì)胞色素C釋放[19]。Bcl-2能與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止Bax釋放，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞的作用；Bcl-2過表達(dá)可以減少氧自由基的產(chǎn)生、抑制ROS的脂質(zhì)過氧化作用[20]。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，一旦被信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，就能降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，使細(xì)胞不可逆地發(fā)生凋亡[20]。Caspase-3屬于Caspase家族的“執(zhí)行者”，可以直接降解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡[20]。存在于線粒體膜上的Bcl-2過表達(dá)時可以抑制線粒體通透性的改變，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制Caspase激活，從而抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2過表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱甘肽（GSH）的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低Caspase的活性。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，ROS與Caspase相互影響，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2作用后的心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上升，表明H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型成功建立；而這一作用均可被加參方浸膏逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果表明，加參方浸膏抑制H2O2致心肌細(xì)胞凋亡的作用可能與其參與調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，加參方浸膏可能通過下調(diào)Caspase-3、Bax和上調(diào)Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。本研究可為加參方相關(guān)制劑研發(fā)及臨床治療心力衰竭提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 陳兆善. 心肌細(xì)胞凋亡與心力衰竭研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2002，8（8）：458-462.

[ 2 ] WEI CD，LI Y，ZHENG HY，et al. Palmitate induces H9c2 cell apoptosis by increasing reactive oxygen species generation and activation of the ERK1/2 signaling pathway[J].Mol Med Rep，2013，7（3）：855-861.

[ 3 ] PANERA N，GNANI D，PIERMARINI E，et al. High concentrations of H2O2 trigger hypertrophic cascade and phosphatase and tensin homologue（PTEN）glutathionylation in H9c2 cardiomyocytes[J]. Exp Mol Pathol，2016，100（1）：199-206.

[ 4 ] CRISPO JA，PICH? M，ANSELL DR，et al. Protective effects of methyl gallate on H2O2 induced apoptosis in PC12 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2010，393（3）：773-778.

[ 5 ] LIU X，MIN Y，GU W，et al. Buyanghuanwu Tang therapy for neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（10）：18448-18454.

[ 6 ] LEE MK，LU Y，DI LQ，et al. Protection of Tong-sai-mai decoction against apoptosis induced by H2O2 in PC12 cells：mechanisms via Bcl-2-mitochondria ROS-iNOS pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2014. DOI：10.1155/2014/371419.

[ 7 ] ZHU MJ，WANG YP，XIE SY，et al. Protective effects of Jiashen prescription on myocardial infarction in rats[J].Chin J Integr Med，2015，21（6）：417-422.

[ 8 ] CUI L，WANG Y，YU R，et al. Jia-Shen decoction medicated serum inhibits angiotensin-Ⅱ induced cardiac fibroblast proliferation via the TGF-β1/Smad signaling pathway[J]. Mol Med Rep，2016，14（2）：1610-1616.

[ 9 ] 郭志軍，高秀梅，王保和，等. 加參方對CHF大鼠縮血管保鈉和擴(kuò)血管排鈉因素的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11（11）：196-197.

[10] ZHOU J，JIANG K，DING X，et al. Qiliqiangxin inhibits angiotensinⅡ-induced transdifferentiation of rat cardiac fibroblasts through suppressing interleukin-6[J]. J Cell Mol Med，2015，19（5）：1114-1121.

[11] WANG T，SUN P，CHEN L，et al. Cinnamtannin D-1 protects pancreatic β-cells from palmitic acid-induced apoptosis by attenuating oxidative stress[J]. J Agric Food Chem，2014，62（22）：5038-5045.

[12] BONAVITA F，STEFANELLI C，GIORDANO E，et al.H9c2 cardiac myoblasts undergo apoptosis in a model of ischemia consisting of serum deprivation and hypoxia：inhibition by PMA[J]. FEBS Lett，2003，536（1/2/3）：85-91.

[13] SCHMITTGEN TD，LIVAK KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T） method[J]. Nat Protoc，2008，3（6）：1101-1108.

[14] 于瑞，崔琳，王幼平，等. 加參方對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖、膠原分泌及分化的實驗研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（11）：2260- 2266.

[15] 王新陸，崔琳，王幼平，等. 加參方對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（5）：2210-2215.

[16] HESCHELER J，MEYER R，PLANT S，et al. Morphological，biochemical，and electrophysiological characterization of a clonal cell （H9c2） line from rat heart[J]. Circ Res，1991，69（6）：1476-1486.

[17] XIANG J，WAN C，GUO R，et al. Is hydrogen peroxide a suitable apoptosis inducer for all cell types？[J]. Biomed Res Int，2016. DOI：10.1155/2016/7343965.

[18] CHANG H，LI C，HUO K，et al. Luteolin prevents H2O2- induced apoptosis in H9C2 cells through modulating Akt-P53/Mdm2 signaling pathway[J]. Biomed Res Int 2016. DOI：10.1155/2016/5125836.

[19] MARTINOU JC，YOULE RJ. Mitochondria in apoptosis：Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J].Dev Cell，2011，21（1）：92-101.

[20] 成軍. 現(xiàn)代細(xì)胞凋亡分子生物學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2012：24-169.

（收稿日期：2018-02-28 修回日期：2018-06-05）

（編輯：段思怡）