甲基蓮心堿對肝缺血再灌注損傷模型小鼠氧化應激和炎癥反應的影響

鄭偉 海軍 宋曉雪 常虎林 杜立學

摘 要 目的：考察甲基蓮心堿對小鼠肝缺血再灌注（I/R）損傷的保護作用及機制。方法：將40只小鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和甲基蓮心堿低、中、高劑量組（10、30、60 mg/kg），每組8只。每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d。給藥結束后，除假手術組外，其余各組小鼠均采用夾閉肝蒂60 min后再灌注6 h復制肝I/R損傷模型。造模結束后，檢測各組小鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）水平，蘇木精-伊紅染色后觀察肝組織病理學變化并進行炎癥評分，檢測肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA及核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）蛋白表達情況。結果：與假手術組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6以及肝組織中MDA、SOD、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）；肝組織間質有大量炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死，炎癥評分顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，除甲基蓮心堿低劑量組小鼠血清中ALT、TNF-α和肝組織中TNF-α mRNA、MDA、 NF-κB p65蛋白表達水平以及肝組織炎癥評分降低不顯著外，其余各組小鼠上述指標水平均顯著降低（P<0.05）；甲基蓮心堿中、高劑量組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞形態基本正常，病理損傷得到顯著改善。結論：甲基蓮心堿對肝I/R損傷模型小鼠具有保護作用，且呈劑量相關性；其作用機制可能與減輕氧化應激、抑制炎癥反應和降低肝組織中NF-κB p65蛋白的表達有關。

關鍵詞 甲基蓮心堿；肝缺血再灌注損傷；小鼠；炎癥反應；氧化應激；核轉錄因子κB p65

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the protective effect and mechanism of neferine on hepatic ischemia/reperfusion （I/R） injury in mice. METHODS： Totally 40 mice were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， and neferine low-dose， middle-dose and high-dose groups （10， 30， 60 mg/kg）， with 8 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically once a day for consecutive 7 d. After medication， except for sham operation group， mice in other groups were given occlusion of liver pedicle 60 min and then given perfusion for 6 h to induce hepatic I/R injury model. After modeling， the levels of ALT， AST， TNF-α and IL-6 were detected. The pathological change of hepatic tissue was observed after HE staining and the inflammation was scored. The levels of MDA， SOD， TNF-α mRNA and IL-6 mRNA， and the protein expression level of NF-κB p65 in hepatic tissue were determined. RESULTS： Compared with sham operation group， serum levels of ALT， AST， TNF-α and IL-6， levels of MDA， SOD， TNF-α mRNA and IL-6 mRNA and the protein expression level of NF-κB p65 in hepatic tissue were increased significantly in model group （P<0.05）. There was a large number of inflammatory cells infiltration and hepatic cells necrosis， and the inflammation score increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， except that serum levels of ALT and TNF-α， levels of TNF-α mRNA and MDA， protein expression level of NF-κB p65 and inflammation score of hepatic tissue were not significantly reduced in neferine low-dose group， above indexes of other groups were decreased significantly （P<0.05）. In neferine middle-dose and high-dose groups， the structure of hepatic lobules was complete， the morphology of hepatocytes was normal， and pathological injury had been significantly improved. CONCLUSIONS： Neferine shows protective effect on hepatic I/R injury model mice in dose-dependent manner， the mechanism of which may be associated with reducing oxidative stress， inhibiting inflammatory reaction and reducing the protein expression of NF-κB p65 in hepatic tissue.

KEYWORDS Neferine； Hepatic ischemia/reperfusion injury； Mice； Inflammation； Oxidative stress； NF-κB p65

肝缺血再灌注損傷[Hepatic ischemia/reperfusion（I/R） injury]是肝移植和肝葉切除手術中不可避免的病理過程，也是誘發術后肝功能恢復延遲、受損甚至是肝衰竭的重要危險因素[1-2]。過度的氧化應激和炎癥反應在肝I/R損傷進展中具有非常重要的作用[3]。甲基蓮心堿是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取出的一種生物堿成分，其在擴血管、抗血小板聚集、降低血糖、調節血脂、抗氧化應激、抗炎癥反應、化療增敏、抗有機磷中毒及抗肝纖維化等方面均具有積極作用[4]。在肝臟疾病方面，甲基蓮心堿可以減輕肝I/R損傷及肝纖維化，但是其具體機制及使用劑量尚不清楚[5-6]。因此，筆者思考甲基蓮心堿是否可通過抗炎、抗氧化來減輕肝I/R損傷？為回答此問題，本研究采用小鼠肝I/R損傷模型，探討甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠氧化應激和炎癥反應的影響，為闡明甲基蓮心堿減輕肝I/R損傷的作用機制及其進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX-51型顯微鏡（日本Olympus公司）；5415D型高速臺式離心機（德國Eppendorf公司）；垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；9700型聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

甲基蓮心堿標準品（大連美倫醫藥科技發展有限公司，批號：MB6707，純度：98%，使用生理鹽水配成相應濃度）；丙氨酸轉氨酶（ALT，貨號：CC009-2）、天冬氨酸轉氨酶（AST，貨號：C010-2）、丙二醛（MDA，貨號：A003-1）和超氧化物歧化酶（SOD，貨號：A001-1-1）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（TNF-α，貨號：1802261）、白細胞介素6（IL-6，貨號：1803251）酶聯免疫吸附（ELISA）測定試劑盒均購于深圳達科為生物技術有限公司；反轉錄試劑盒及逆轉錄-PCR（RT-PCR）擴增試劑盒均購自大連Takara公司；兔抗小鼠核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）一抗（北京博奧森生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RT-PCR試驗中引物由上海生工生物技術公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級健康C57BL/6小鼠40只，♂，6～8周齡，體質量22～26 g，購自西安交通大學醫學部動物實驗中心，動物使用合格證號：SYXK（陜）2015-002。小鼠購入后飼養于溫度為22 ℃、相對濕度為50%、12 h/12 h明暗交替的動物房中，飼養期間自由飲食。

2 方法

2.1 小鼠肝I/R損傷模型的建立

小鼠術前禁食不禁水12 h，以戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，取上腹部中線正中切口開腹，游離出肝蒂，用無損傷血管夾夾閉肝蒂60 min后，撤離血管夾以恢復血流制成肝I/R損傷（可見缺血肝葉顏色由暗灰色變為暗紅色）[7]，并逐層關腹。

2.2 分組、給藥與造模

將小鼠適應性飼養1周后隨機分為假手術組、模型組和甲基蓮心堿低、中、高劑量組，每組8只。甲基蓮心堿低、中、高劑量組小鼠灌胃甲基蓮心堿10、30、60 mg/kg[8]，假手術組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥7 d。給藥結束后，模型組和甲基蓮心堿低、中、高劑量組小鼠按“2.1”項下方法制備肝I/R損傷模型，假手術組小鼠行假手術（僅麻醉后行開腹和關腹處理，不阻斷肝臟血流）。再灌注6 h后，收集各組小鼠的血液、肝左葉及肝中葉標本。將血液在4 ℃條件下以1 500×g離心10 min，收集血清，將血清標本于-80 ℃條件下凍存；組織標本經液氮迅速冷凍后，同樣于-80 ℃條件下凍存。

2.3 血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6水平測定

取血清，分別按照相應試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6水平。

2.4 肝組織病理形態學觀察

取肝組織，常規石蠟包埋處理后行4 μm切片，脫蠟、透明后行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肝組織的病理形態學變化并進行炎癥評分。評分標準如下[9]：沒有炎癥細胞，0分；血管周圍少量炎性細胞浸潤，1分；炎癥細胞形成環狀，層厚約1個細胞，2分；炎性細胞形成環狀，層厚約2～4個細胞，3分；炎癥細胞形成環狀，層厚約4～5個細胞，4分。

2.5 肝組織中MDA、SOD水平測定

取新鮮肝組織0.1 g，用4 ℃生理鹽水洗盡淤血，濾紙吸干水分，稱質量。將其放入玻璃勻漿管口剪碎，加入9倍體積（mL）的冷生理鹽水進行勻漿，制成10%的勻漿液，然后在4 ℃條件下以6 000×g離心10 min，收集上清液，按照相應試劑盒說明書操作，檢測上清液中MDA、SOD水平。

2.6 肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平測定

采用RT-PCR法進行測定。取各組小鼠凍存的肝組織100 mg，按Trizol法抽提總RNA，反轉錄合成cDNA，然后按照RT-PCR擴增試劑盒說明書操作擴增目的基因。TNF-α引物序列：上游引物序列為5′ -ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′ ，下游引物序列為5′ -GAGAACCTGGGAGTAGACAAGG-3′ ，擴增片段長度為146 bp；IL-6上游引物序列為5′ -CAACGGGTGGAACATTACC-3′ ，下游引物序列為5′ -GGGTTTGCGTTTGTGA-3′ ，擴增片段長度為422 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列為5′ -CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3′ ，下游引物序列為5′ -TTGATGGCAACAATCTCCAC-3′ ，擴增片段長度為452 bp。反應體系：熒光染料SYBR mix 11 μL，滅菌蒸餾水9 μL，2 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，體系總計22 μL。擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共40個循環；以37 ℃再延伸5 min結束反應。采用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達水平（式中ct值表示目標基因達到設定閾值所需的循環次數）。

2.7 肝組織中NF-κB p65蛋白表達水平測定

采用免疫組化法進行測定。按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法將包埋的蠟塊切成4 μm薄片，使用100 g/L牛血清白蛋白封閉1 h，加入兔抗小鼠NF-κB p65一抗（1 ∶ 400），4 ℃孵育過夜，2%過氧化氫孵育10 min，清除內源性過氧化物酶。加入辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗（1 ∶ 200），并加入底物二喹啉甲酸顯色。最終將免疫組化的切片在顯微鏡下進行觀察并拍照。鏡下選取免疫組化切片的中心位置，在20倍物鏡下統計每個視野中約200個細胞，對組織標本中的陽性細胞染色程度與數目進行計分，通過上述兩項計分的乘積判定表達強度[10]。陽性細胞染色程度評分的判定：細胞沒有明顯染色，計0分；細胞出現淺黃色染色，計1分；細胞出現棕黃色染色，計2分；細胞出現棕褐色染色，計3分。陽性細胞數目計分的判定：無陽性細胞或陽性細胞率不足10%，計為0分；陽性細胞率10%～25%，計為1分；陽性細胞率25%～50%，計為2分；陽性細胞率50%～75%，計為3分；陽性細胞率>75%，計為4分。染色深淺應與背景著色對比，排除非特異性染色。最終免疫組化半定量得分=陽性細胞數目計分×染色程度評分。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism software 6.0對實驗數據進行處理。計量資料以x±s表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，各組樣本間的兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠血清中ALT、AST水平的影響

與假手術組比較，其余各組小鼠血清中ALT、AST水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠血清中ALT、AST水平均不同程度降低，其中甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05）；與甲基蓮心堿低劑量組比較，甲基蓮心堿高劑量組小鼠血清中ALT水平和甲基蓮心堿中、高劑量組小鼠血清中AST水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中ALT、AST水平測定結果見表1。

3.2 甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠肝組織病理形態學的影響

小鼠肝I/R后整體成充血水腫狀，表面暗黑淤血面積增大，紅潤面積減少；HE染色后顯示，模型組小鼠肝組織內可見大量出血，間質組織大量炎性細胞浸潤，大量片狀的肝細胞壞死。甲基蓮心堿低劑量組小鼠肝細胞內可見大量脂滴形成，炎性細胞浸潤及細胞空泡化。而甲基蓮心堿中、高劑量組小鼠肝組織小葉結構基本完整，肝細胞形態基本正常，少量炎性細胞浸潤。各組小鼠肝組織病理形態觀察結果見圖1。

根據肝組織病理結果對炎癥進行評分。與假手術組比較，其余各組小鼠炎癥評分顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠炎癥評分均不同程度降低；其中，甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05），且顯著低于甲基蓮心堿低劑量組（P<0.05）。假手術組、模型組和甲基蓮心堿低、中、高組小鼠肝組織炎癥評分依次為0、（3.3±0.7）、（3.1±0.6）、（2.3±0.7）、（2.2±0.9）分（n=8）。

3.3 甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠局部及全身炎癥反應的影響

3.3.1 血清中TNF-α、IL-6水平 與假手術組比較，其余各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均不同程度降低，其中甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05）。與甲基蓮心堿低劑量組比較，甲基蓮心堿高劑量組小鼠血清中TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平測定結果見表2。

3.3.2 肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平 與假手術組比較，其余各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平均不同程度降低，其中甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05）。與甲基蓮心堿低劑量組比較，甲基蓮心堿高劑量組小鼠肝組織中TNF-α mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平測定結果見表3。

3.4 甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠氧化應激的影響

與假手術組比較，其余各組小鼠肝組織中MDA水平顯著升高、SOD水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠肝組織中MDA水平不同程度降低、SOD水平不同程度升高，其中甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05）。與甲基蓮心堿低劑量組比較，甲基蓮心堿中、高劑量組小鼠肝組織中MDA水平顯著降低、SOD水平顯著升高（P<0.05）。各組小鼠肝組織中MDA、SOD水平測定結果見表4。

3.5 甲基蓮心堿對肝I/R損傷小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達的影響

與假手術組比較，其余各組小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，甲基蓮心堿各劑量組小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達水平不同程度降低，其中甲基蓮心堿中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05），并且甲基蓮心堿高劑量組小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達水平顯著低于甲基蓮心堿低劑量組（P<0.05）。假手術組、模型組和甲基蓮心堿低、中、高劑量組小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達評分依次為0、（9.5±1.2）、（9.0±1.3）、（7.2±1.3）、（5.7±1.5）分（n=8），免疫組化圖見圖2。

4 討論

肝I/R損傷在肝外科手術中不可避免，這一過程對肝細胞形態及功能均會產生損傷作用，是引起術后早期肝功能不全或肝功能衰竭的主要原因[11]。肝I/R損傷的機制復雜，包括肝實質細胞及間質細胞之間的相互作用，過度的炎癥反應及氧自由基生成等[12-14]。因目前針對I/R損傷尚無規范、統一的治療方法，故在本研究中暫未設置陽性對照。

通過病理學觀察可以發現，肝I/R損傷后小鼠肝組織發生肝細胞大量變性壞死、血竇區充血及出血、管區炎性細胞浸潤等現象，并且肝細胞受損時釋放大量ALT、AST入血，而導致血清中ALT、AST水平急劇升高。本研究發現，甲基蓮心堿可以明顯減輕肝I/R損傷后小鼠肝組織的病理改變，肝細胞變性及壞死區域明顯減少，同時血清中ALT、AST水平也顯著降低，提示甲基蓮心堿對小鼠肝I/R損傷具有一定的保護作用。

過度的炎癥反應在肝I/R損傷的進展中具有重要作用。肝缺血時炎癥反應被廣泛激活，大量的中性粒細胞、巨噬細胞等效應細胞活化并浸潤至損傷部位，同時產生并分泌大量的炎癥介質，引起局部及全身的器官損傷[15]。NF-κB是體內廣泛分布的一種真核細胞轉錄因子，可以被多種因素激活，參與細胞調亡、炎癥等生理病理過程，可調控炎癥因子及趨化因子的表達。p65亞單位是NF-κB的重要活性組分，筆者對肝組織中NF-κB p65蛋白的表達部位及水平進行了檢測，證實了甲基蓮心堿能夠顯著降低肝I/R損傷小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白的表達。缺血刺激可誘發機體內的NF-κB激活，而激活的NF-κB可誘發肝臟炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的表達和釋放，同時這些炎癥細胞因子又可以促進NF-κB的活化，形成惡性循環，擴大炎癥反應[16-17]。本研究通過ELISA法檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平和免疫組化法檢測各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA水平，從全身及局部炎癥反應角度證實了甲基蓮心堿不僅可以抑制NF-κB表達，而且可以降低其下游炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的水平，從而發揮對肝I/R損傷的保護作用。

體內氧化應激失衡也是肝I/R損傷的重要病理機制。氧自由基是機體氧分子不完全代謝的產物，在肝I/R損傷時，氧自由基產生增多且清除系統的功能發生障礙不能將自由基清除，過多的自由基可與線粒體膜上的多價不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，導致細胞凋亡和壞死。MDA是非飽和脂質過氧化反應的終產物，是氧化應激水平的“正向指標”；而SOD反應了機體抗氧化能力，是氧化應激水平的“反向指標”[18]。本結果顯示，小鼠肝IR損傷后肝組織中MDA水平顯著升高、SOD水平顯著顯降低，而甲基蓮心堿可明顯降低肝IR損傷小鼠肝組織中MDA水平，并升高肝組織中SOD水平，表明甲基蓮心堿能夠明顯抑制肝IR損傷后的氧化應激反應。

綜上所述，甲基蓮心堿對小鼠肝IR損傷具有明顯的保護作用，且以中、高劑量效果較好，其作用機制可能與降低肝脂質過氧化應激反應損傷，加強機體的抗氧化應激能力，抑制炎癥反應及肝組織中NF-κB p65蛋白的表達有關。

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（收稿日期：2018-03-06 修回日期：2018-05-28）

（編輯：林 靜）