葶藶生脈口服液的HPLC指紋圖譜研究

李佳佳 頓佳穎 鄭鵬 張靜宜 李春花

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）18-2505-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.14

摘 要 目的：建立葶藶生脈口服液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為YMC Jsphere ODS-H80，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203、270 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為30 μL。以丹酚酸B為參照，繪制10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。結(jié)果：10批樣品的HPLC圖譜在203 nm波長(zhǎng)處有21個(gè)共有峰，在270 nm波長(zhǎng)處有17個(gè)共有峰，相似度為0.981～0.999；經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品的HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：所建指紋圖譜可為葶藶生脈口服液的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 葶藶生脈口服液；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Tingli shengmai oral liquid. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on YMC Jsphere ODS-H80 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 203 nm and 270 nm， respectively. The column temperature was 30 ℃， and the sample size was 30 μL. Using salvianolic acid B as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of sample were established. TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A） was used to evaluate the similarity so as to confirm common peak. RESULTS： There were 21 common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples at 203 nm， and 17 common peaks at 270 nm. The similarity was 0.981-0.999. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample were good in agreement with control fingerprint. CONCLUSIONS： Established fingerprints can provide reference for quality evaluation of Tingli shengmai oral liquid.

KEYWORDS Tingli shengmai oral liquid； HPLC； Fingerprint

葶藶生脈方由丹參、黃芪、麥冬、五味子、桂枝、茯苓、白術(shù)、葶藶子等13味中藥材組合而成，主要用于證屬氣虛血瘀、陽(yáng)虛水停型充血性心力衰竭的治療。全方配伍攻補(bǔ)兼施，扶正不礙邪，驅(qū)邪不傷正，補(bǔ)氣而無(wú)溫燥之弊，化瘀不傷血，利水不傷陰，共奏益氣溫陽(yáng)、活血利水之效。目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的是葶藶生脈方的藥效及作用機(jī)制研究[1-4]，而對(duì)其質(zhì)量控制方面研究較少。

中藥飲片藥效成分大多為多種活性成分，而傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法僅對(duì)其中單一或幾個(gè)活性成分進(jìn)行定性、定量分析，這使中藥材及制劑的質(zhì)量無(wú)法得到全面控制。中藥指紋圖譜可利用宏觀規(guī)律性的特征分析中藥的共有特征，既可確認(rèn)產(chǎn)品的真?zhèn)危瑫r(shí)又能判斷質(zhì)量的穩(wěn)定與否。葶藶生脈口服液是在葶藶生脈方的基礎(chǔ)上經(jīng)現(xiàn)代工藝精制而成的中藥口服制劑，目前尚未見(jiàn)有關(guān)葶藶生脈口服液的指紋圖譜研究報(bào)道[5-7]。為了更全面地控制該制劑的質(zhì)量，保證其臨床療效，本試驗(yàn)參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[8]及相關(guān)文獻(xiàn)[9-17]建立了以丹酚酸B為參照的葶藶生脈口服液高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC 儀，包括2489紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器等（美國(guó)Waters公司）；TG328B型電子分析天平（上海精科儀器有限公司）；SAS 67120型超純水系統(tǒng)（法國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

葶藶生脈口服液（河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20171001～20171010，規(guī)格：10 mL/支）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16110407，純度：98.10%）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16042709，純度：98.86%）、羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)：MUST- 13121913，純度：98%）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17022401，純度：99.78%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16010415，純度：98%）、丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15122610，純度：98%）、隱丹參酮對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15122007，純度：98%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-200613，純度：98%）；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Jsphere ODS-H80（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，15% A→21% A；15～35 min，21% A→26% A；35～50 min，26% A→34% A；50～70 min，34% A→61% A；70～85 min，61% A→75% A；85～90 min，75% A→95% A；90～100 min，95% A→100% A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203、270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：30 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取各待測(cè)成分對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A、五味子甲素、黃芪甲苷質(zhì)量濃度分別為0.56、0.24、0.28、0.30、0.44、0.52、0.28、0.22 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10 mL，濃縮至近干，殘?jiān)?0%甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL棕色量瓶中，用70%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20171001）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以丹酚酸B峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20171001）適量，分別于室溫下放置0、3、8、13、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以丹酚酸B峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：20171001）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以丹酚酸B峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成、相似度分析及共有峰的相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A），以樣品共有模式為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品相似度為0.981～0.999，表明樣品批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性較好，詳見(jiàn)表1、表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 在203 nm波長(zhǎng)處有21個(gè)共有峰，在270 nm波長(zhǎng)處有17個(gè)共有峰；通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了其中8個(gè)共有峰，在203 nm波長(zhǎng)處分別指認(rèn)出人參皂苷Rg1（峰3）、丹酚酸B（峰4）、人參皂苷Rb1（峰5） 、黃芪甲苷（峰6），在270 nm波長(zhǎng)處分別指認(rèn)出羥基紅花色素A（峰1）、丹酚酸B（峰4）、隱丹參酮（峰15）、五味子甲素（峰16）、丹參酮ⅡA（峰17）。在樣品圖譜中選擇峰面積較大、出峰時(shí)間適中且穩(wěn)定的4號(hào)峰（丹酚酸B峰）為參照峰，計(jì)算其他峰相對(duì)于4號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表3～表6。

3 討論

葶藶生脈口服液由13味中藥材提取制成，方中藥味較多、成分復(fù)雜，本研究選擇了其中具有代表性的8種指標(biāo)成分進(jìn)行考察，皂苷類成分適合在203 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，丹參的主要成分適合在270 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。因此，本研究采用雙波長(zhǎng)（203、270 nm）檢測(cè)樣品，在203 nm波長(zhǎng)處可檢測(cè)到人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷，在270 nm波長(zhǎng)處可檢測(cè)到羥基紅花色素A、丹酚酸B、隱丹參酮、五味子甲素、丹參酮ⅡA。

預(yù)試驗(yàn)中，筆者曾選擇乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相進(jìn)行比較。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相時(shí)，樣品色譜圖出峰較多，且各峰分離度較好，基線平穩(wěn)，同時(shí)此條件較溫和，酸度不高，對(duì)色譜柱損害較小，因此最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相。

指紋圖譜研究中，需選擇一個(gè)參照物作為標(biāo)準(zhǔn)。中藥制劑參照物的選擇原則一般為君藥中的主要有效成分，其次才是其他有效成分，再次是大量存在的指標(biāo)成分，最后方可考慮選擇一定的內(nèi)標(biāo)作為參照物。可以根據(jù)峰值比，控制相對(duì)量，以判斷制劑的質(zhì)量。故本試驗(yàn)選取了樣品中君藥丹參的主要有效成分丹酚酸B為參照物。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為葶藶生脈口服液的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2017-12-09 修回日期：2018-02-12）

（編輯：張 靜）