婦科再造丸的體外溶出度測定

鄭曉霞 徐劍 田洪星 胡蝶 劉慧

中圖分類號(hào) R283.6；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）18-2497-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.12

摘 要 目的：建立測定婦科再造丸體外溶出度的方法。方法：采用高效液相色譜法測定制劑中黃芩苷和橙皮苷的含量，色譜柱為WondaSil-C18，流動(dòng)相為0.2%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL；采用槳法測定制劑的累積溶出度，溶出介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37±0.5）℃，取樣量為2 mL。結(jié)果：黃芩苷和橙皮苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.936～23.12 μg/mL（r=0.999 8）、0.620～3.10 μg/mL（r=0.999 0）；定量限分別為4.624、0.620 μg/mL，檢測限分別為2.312、0.155 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率分別為95.28%～99.22%（RSD=0.97%，n=9）、96.10%～99.84%（RSD=1.98%，n=9）。樣品中黃芩苷和橙皮苷10 h時(shí)的平均累積溶出度分別為（97.10±0.09）%、（78.50±0.08）%；溶出63.2%所需時(shí)間（TD）分別為（1.88±0.12）、（3.26±0.10）h，溶出50%所需時(shí)間（T50）分別為（0.88±0.09）、（1.67±0.14）h。結(jié)論：該方法操作簡便、準(zhǔn)確，可用于婦科再造丸的體外溶出度測定。

關(guān)鍵詞 婦科再造丸；槳法；體外溶出度

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of in vitro dissolution of Fuke zaizao pills. METHODS： HPLC method was adopted to determine the contents of baicalin and hesperidin in preparation. The determination was performed on WondaSil-C18 column with mobile phase consisted of 0.2% formic acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. The dissolution of the preparation was determined by paddle method using phosphate buffer solution （pH 6.8） as dissolution medium with rotate speed of 100 r/min，temperature was （37±0.5）℃， sample size was 2 mL. RESULTS： The linear range of baicalin and hesperidin were 6.936-23.12 μg/mL （r=0.999 8） and 0.620-3.10 μg/mL （r=0.999 0）， respectively. Limits of quantitation were 4.624， 0.620 μg/mL， limits of detection were 2.312， 0.155 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 2%； the recoveries were 95.28%-99.22% （RSD=0.97%，n=9） and 96.10%-99.84% （RSD=1.98%，n=9）， respectively. The accumulative dissolution rates of baicalin and hesperidin in sample were （97.10±0.09）% and （78.50±0.08）% at 10 h， respectively. TD were （1.88±0.12）、（3.26±0.10）h，T50 were （0.88±0.09）、（1.67±0.14）h， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple and accurate， and can be used for the determination of in vitro dissolution of Fuke zaizao pills.

KEYWORDS Fuke zaizao pill； Paddle method； in vitro dissolution rate

婦科再造丸主要由當(dāng)歸、白芍、地黃、益母草、阿膠、杜仲等42味中藥材組合而成，可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、補(bǔ)益肝腎、暖宮止痛，在臨床上常用于治療月經(jīng)不調(diào)等婦科慢性病。近年來研究表明，婦科再造丸對(duì)子宮肌瘤[1-2]、乳腺增生、黃褐斑、不孕、婦科炎癥復(fù)發(fā)[3]等有一定的改善效果，并且還對(duì)黑色素細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用[4-6]。目前，評(píng)價(jià)中藥口服固體制劑質(zhì)量的方法主要是體外溶出度試驗(yàn)，其不僅可用于指導(dǎo)處方篩選和產(chǎn)品開發(fā)以獲得最佳處方、制劑工藝和劑型，還可用于評(píng)價(jià)中藥口服固體制劑的體內(nèi)生物利用度。婦科再造丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)研究尚不全面，僅有個(gè)別藥材的薄層鑒別[7-8]、顯微鑒定[9]及少數(shù)成分的含量測定[10-12]，尚無溶出度測定的研究。因此，有必要建立符合婦科再造丸特點(diǎn)的溶出度測定方法。本試驗(yàn)以黃芩苷、橙皮苷為指標(biāo)成分，以不同溶出介質(zhì)模擬體內(nèi)環(huán)境，優(yōu)選婦科再造丸的最佳溶出介質(zhì)，并考察該制劑中上述指標(biāo)成分的體外溶出特征，旨在為提高和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器等（美國Agilent公司）；SK8200型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；JA2003型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RC-3型溶出度測試儀（天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

婦科再造丸（貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z20025056，批號(hào)：20111247，規(guī)格：0.26 g/丸）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：H-016-140729，純度：99.9%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：C-006-140728，純度：99.9%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～22 min，2% B→20% B；22～30 min，20% B→28% B；30～36 min，28% B→35% B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 緩沖液 制備磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）[13]，室溫靜置，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取黃芩苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品各適量，分別置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得單一對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取不同時(shí)間點(diǎn)的溶出液各適量，以10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 按婦科再造丸處方和工藝分別制備缺黃芩或陳皮的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成各自陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按黃芩苷、橙皮苷峰計(jì)均不低于3 000；基線分離良好，分離度均大于1.5。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照在與黃芩苷、橙皮苷對(duì)照品保留時(shí)間相同處無干擾峰，表明本方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成黃芩苷質(zhì)量濃度為6.936、9.248、11.560、13.872、18.496、23.120 μg/mL，橙皮苷質(zhì)量濃度為0.155、0.31、0.62、0.93、1.24、1.55、1.86、2.48、3.10 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以黃芩苷和橙皮苷質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷和橙皮苷回歸方程分別為y=17.426x-11.563（r=0.999 8）、y=189.51x-1.315 6（r=0.999 0）。結(jié)果表明，黃芩苷和橙皮苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.936～23.12、0.620～3.10 μg/mL。

2.6 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限與檢測限[13]。結(jié)果，黃芩苷和橙皮苷的定量限分別為4.624、0.620 μg/mL，檢測限分別為2.312、0.155 μg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為1.20%、0.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為0.20%、0.30%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，黃芩苷和橙皮苷含量平均值分別為0.9、5.0 μg/mL，RSD分別為0.17%、0.30%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品9份，每份1 g，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的待測成分對(duì)照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.11 溶出度測定

2.11.1 溶出介質(zhì)考察 按2015年版《中國藥典》（四部）通則“溶出度與釋放度測定法”項(xiàng)下槳法[13]進(jìn)行操作，選擇4種經(jīng)超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）脫氣處理的不同溶出介質(zhì)[磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）、蒸餾水、人工胃液、人工腸液][13]，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37±0.5）℃，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h時(shí)取樣2 mL，并補(bǔ)加等量同溫溶出介質(zhì)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定黃芩苷和橙皮苷在不同溶出介質(zhì)中各取樣時(shí)間點(diǎn)的含量，并計(jì)算累積溶出度：累積溶出度=（ρ1+ρ2+………ρn+ρn+1）V取/（ρ0V總）（式中，ρn為第n個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度，V總為溶出體積，V取為取樣體積，ρ0為取樣前溶液的質(zhì)量濃度），結(jié)果見圖2。

由圖2可知，黃芩苷和橙皮苷在人工腸液中未被檢出，而在磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中的總體累積溶出度最大，因此，確定磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）為樣品的溶出介質(zhì)。

2.11.2 樣品溶出度測定 稱取樣品6份，每份約為2.6 g（1次給藥劑量），按2015年版《中國藥典》（四部）通則“溶出度與釋放度測定法”項(xiàng)下槳法[13]進(jìn)行操作，溶出介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37±0.5）℃，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h時(shí)取樣2 mL，并補(bǔ)加等量同溫溶出介質(zhì)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行操作6次，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量并計(jì)算平均累積溶出度，結(jié)果見表2。

2.11.3 樣品體外溶出動(dòng)力學(xué)分析 將樣品中黃芩苷和橙皮苷的平均累積溶出度數(shù)據(jù)分別以零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull、Higuchi、Retger-peppas模型進(jìn)行擬合[14-15]，結(jié)果見表3（表中，Q為平均累積溶出度，t為取樣時(shí)間）。

由表3可知，樣品中黃芩苷和橙皮苷的體外溶出動(dòng)力學(xué)均符合Weibull模型，將所得數(shù)據(jù)帶入回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得黃芩苷和橙皮苷溶出63.2%所需時(shí)間（TD）分別為（1.88±0.12）、（3.26±0.10）h；溶出50%所需時(shí)間（T50）分別為（0.88±0.09）、（1.67±0.14）h。

3 討論

影響口服固體制劑溶出度的因素有溶出方法、轉(zhuǎn)速及溶出介質(zhì)等，因此，預(yù)試驗(yàn)中筆者考察了樣品在不同方法（槳法、籃法）、不同轉(zhuǎn)速（50、75、100、125 r/min）、不同溶出介質(zhì)[蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）、人工胃液、人工腸液]條件下的溶出情況。結(jié)果表明，在槳法、轉(zhuǎn)速100 r/min、磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）條件下，樣品中黃芩苷和橙皮苷的溶出度最佳；而在人工腸液中未檢出上述成分，可能是由于兩種成分在其中不穩(wěn)定造成的。

通過對(duì)樣品體外溶出度的測定發(fā)現(xiàn)，以黃芩苷和橙皮苷為指標(biāo)成分的婦科再造丸的體外溶出動(dòng)力學(xué)符合Weibull模型。此結(jié)論可為該藥在體內(nèi)的生物利用度評(píng)價(jià)提供一定參考。

綜上所述，該方法操作簡便、準(zhǔn)確，可用于婦科再造丸的體外溶出度測定。

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（收稿日期：2017-12-07 修回日期：2018-03-19）

（編輯：張 靜）