楊樹腐爛病菌與不同寄主互作后致病力分化研究

嚴海璘 張王斌 朱宗財 儀子博 王飛亞 岳娟

摘要： 將DSYS菌株接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條及葉片上進行發病率、顯癥時間、產孢體出現時間、病斑擴展速度的研究結果表明，DSYS菌株均能使4種不同寄主健康的枝條發病，在胡楊和灰楊枝條上第3 d開始顯癥，顯癥時間最早；在新疆楊枝條上第10 d開始顯癥，顯癥時間最晚，且產孢體形成需要時間最長達到14 d；在銀白楊枝條上病斑擴展速度最快，為1.46 cm/d。DSYS菌株經歷不同寄主培養后，繼代菌株在病斑擴展速度和發病特征上發生明顯分化現象，在新疆楊和灰楊連續培養3代后病斑擴展速度呈增加趨勢且達到顯著性差異，在胡楊連續培養3代后病斑擴展速度沒有達到顯著性差異，在銀白楊上連續培養后病斑擴展速度在繼2代與繼1代和繼3代表現上有顯著性差異。

關鍵詞： 楊樹腐爛病菌； 致病性； 抗病性； 擴展速度； 產孢體

中圖分類號： S 718. 8， S 792. 11 文獻標識碼： A

文章編號： 1001 - 9499 （2018） 02 - 0020 - 05

楊樹是新疆主要防護林樹種之一，在綠洲農業生產中起著極其重要的作用。近年來，楊樹腐爛病（Cytospora chrysosperma）發生蔓延迅速，造成大面積防護林帶死亡，給脆弱的的綠洲生態農業帶來極大的威脅。新疆是林木腐爛病發生最嚴重的地區之一， 其中楊樹腐爛病的發生程度最為嚴重[ 1 - 4 ]。通過測定4種不同寄主對楊樹腐爛病菌的抗病性和不同寄主繼代菌株的致病性，為進一步探索楊樹與腐爛病間的互作及進行抗病育種提供數據基礎。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌種

供試菌種為南疆農業有害生物綜合治理重點實驗室保存的楊樹腐爛病菌菌株DSYS，分離于阿拉爾11團的楊樹發病枝條上，按常規的組織分離法[ 5 ]分離，經單孢分離后獲得純菌株，用甘油管藏法在-80 ℃冰箱中保存，試驗前在PDA平板上25 ℃全光照培養3天活化以備用。

1. 1. 2 供試培養基

PDA培養基：土豆200 g，加蒸餾水1 000 ml，沸水煮30 min后過濾上清液，加入蒸餾水補至總體積1 000 ml，加瓊脂20 g，葡萄糖20 g，煮至瓊脂融化，121 ℃，30 min高溫滅菌備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 枝條組織燙傷法

在阿拉爾市塔里木大學校園內于下午15時至16時采集1～2年生健康且生長一致的新疆楊（Populus bolleana）、銀白楊（Populus alba）下部枝條；在阿拉爾市塔里木大學東門外于下午15時至16時采集1～2年生健康且生長一致的胡楊（Populus euphratica）、灰楊（Populus pruinosa）下部枝條。將采集的枝條截成15cm長小段，先用蒸餾水沖洗枝條3遍，之后用75%酒精擦拭，再用無菌水沖洗3遍。將無菌打孔器在酒精燈上燒熱后在枝條上打出直徑5 mm的圓形傷口，再將DSYS菌株用打孔器打成直徑5 mm菌餅接種在傷口處。然后將接種好的同一樹種的枝條每10支放在一個消毒盤中，消毒盤底部用一層紗布鋪墊，并倒入適量無菌水保濕，最后用保鮮膜將消毒盤口封住，在25 ℃全光照培養箱中培養觀察。

1. 2. 2 葉片組織針刺法

葉片組織針刺法采[ 6 ]用10針針刺法接種腐爛病菌。在南疆農業有害生物綜合治理重點實驗室周圍，于下午15時至16時采集健康且生長大致相同的新疆楊葉片若干，將葉片用蒸餾水沖洗3遍后，用75%酒精表面消毒，再用無菌水沖洗3遍后備用。將消毒針燒紅滅菌，在葉片正面刺10針，刺傷部位應均勻分布在直徑5 mm的圓形區域內，并避開葉片主脈。將直徑5 mm菌餅接種在針刺處，接種好的葉片放于大塑料皿中，皿內用紗布鋪墊，倒入適量無菌水保濕，每個皿內放一片葉片，在25 ℃全光照培養箱中培養觀察。

1. 2. 3 繼代菌株的獲取

采用組織燙傷法將DSYS菌株分別接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條上，待顯癥并出現白色產孢體后，進行分離和純化，獲得不同寄主的繼1代菌株，即新疆楊繼1代菌株、銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株，采用上述方法，將不同寄主繼1代菌株接種到新的枝條上進行培養、分離和純化，繼而獲得不同寄主繼2代菌株和繼3代菌株。

1. 3 研究內容

1. 3. 1 DSYS菌株對4種寄主的致病性

采用枝條組織燙傷法將DSYS菌株分別接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條上進行培養，觀察、記錄其在各寄主上的發病率、開始顯癥時間、產孢體形成時間和病斑擴展速度（采用十字交叉法）。

1. 3. 2 不同寄主繼1代菌株對新疆楊的致病性

將新疆楊繼1代菌株、銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株采用枝條組織燙傷法及葉片組織針刺法接種在新疆楊枝條及葉片上，觀察、記錄不同寄主繼1代菌株在新疆楊枝條及葉片上的發病率、開始顯癥時間、產孢體形成時間和病斑擴展速度。

1. 3. 3 不同寄主繼2代和繼3代菌株對新疆楊的致病性

將不同寄主繼2代菌株和繼3代菌株采用葉片組織針刺法接種在新疆楊葉片上，觀察、記錄不同寄主繼2代和繼3代菌株在新疆楊葉片上的發病率、開始顯癥時間、病斑擴展速度和發病特征。

2 結果與分析

2.1 DSYS菌株對4種寄主的致病性

試驗結果（表1）表明，DSYS菌株均能使健康的楊樹枝條發病。胡楊、灰楊與新疆楊枝條開始顯癥時間明顯不同，胡楊和灰楊的枝條最早發病，新疆楊的枝條最晚發病。灰楊枝條在第8天形成產孢體，而新疆楊枝條在第14天出現產孢體。病斑擴展速度在不同寄主上存在明顯差異，其中銀白楊和胡楊間達到了顯著性差異。新疆楊枝條的產孢體較少且稀疏，銀白楊和胡楊產孢體特征相同；灰楊枝條形成的產孢體較多且主要集中在病斑周圍，與其它3種不同寄主枝條產孢體特征有較大差異。

2. 2 不同寄主繼1代菌株對新疆楊的致病性

將4種不同寄主繼1代菌株接種到新疆楊枝條和葉片上的觀測結果（表2）表明，4種不同寄主繼1代菌株均能使新疆楊枝條和葉片發病，發病率一致。4種不同寄主繼1代菌株接種新疆楊枝條后第3天開始顯癥；接種新疆楊葉片后，銀白楊繼1代菌株較其它3種寄主繼1代菌株開始顯癥時間晚1天。灰楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后形成產孢體時間最早，新疆楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后形成產孢體時間最晚，銀白楊繼1代菌株和胡楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后形成產孢體的時間相同。銀白楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后病斑擴展速度最快，胡楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后病斑擴展速度最慢，且4種楊樹繼1代菌株接種新疆楊枝條后的病斑擴展速度存在顯著性差異。胡楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后產生的病斑擴展速度最快，銀白楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后產生的病斑擴展速度最慢，且銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度存在顯著性差異，銀白楊繼1代菌株和新疆楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度無顯著性差異。

2. 3 不同寄主繼2代菌株對新疆楊的致病性

觀測結果（表3）表明，4種不同寄主繼2代菌株均能使新疆楊葉片發病，且發病率均為100%。胡楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度最快，銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度最慢。新疆楊繼2代菌株、銀白楊繼2代菌株和胡楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度有顯著性差異，胡楊繼2代菌株和灰楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度無顯著性差異。4種不同寄主繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑均呈黑褐色，且侵染完全后葉片均呈褐色，散發茶葉味。新疆楊繼2代菌株和銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后都是從葉片邊緣開始發病，而胡楊繼2代菌株和灰楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后都是從針刺部位開始發病。

2. 4 不同寄主繼3代菌株對新疆楊的致病性

觀測結果（表4）表明，4種不同寄主繼3代菌株均能使新疆楊葉片發病，且發病率均為100%。銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后第2天才開始發病。灰楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度最快，銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度最慢。4種楊樹繼3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴展速度有顯著性差異。新疆楊繼3代菌株、胡楊繼3代菌株和灰楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后發病時均從針刺部位開始出現黑褐色病斑，且侵染完全后葉片呈褐色散發茶葉味，而銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后黑褐色病斑分散在葉片表面及周圍，只有很淡的茶葉味。

2. 5 4種不同寄主不同繼代菌株致病力的變化

新疆楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，開始發病時間和發病率相同，病斑擴展速度隨代數的增加而增加，且存在顯著性差異。銀白楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，發病率相同，開始發病時間減少后又增加，病斑擴展速度增加后又減少，且銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后的病斑擴展速度與銀白楊繼1代和銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后的病斑擴展速度存在顯著性差異，銀白楊繼1代與銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后在病斑擴展速度上無顯著性差異。胡楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，開始發病時間和發病率相同，病斑擴展速度增加后又減少，但是3代之間病斑擴展速度無顯著性差異。灰楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，開始發病時間和發病率相同，病斑擴展速度隨代數增加而增加，且存在顯著性差異（圖1）。

3 結 語

3. 1 4種不同寄主對來源于腐爛病菌DSYS菌株的抗性在不同方面的表現存在明顯差異，新疆楊接種后潛育期較長且產孢體形成需要時間較長，但在胡楊上潛育期較短，病斑擴展速度較慢。DSYS菌株經歷不同寄主培養后，繼代菌株致病力發生明顯分化現象，在胡楊上連續培養3代后致病性變化沒有達到顯著性差異，在新疆楊和灰楊上連續培養后致病性呈現增強趨勢且達到顯著差異，在銀白楊上連續培養后致病性表現出不穩定現象。

3. 2 將楊樹腐爛病菌DSYS接種在新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊離體枝條上的觀測結果表明，DSYS菌株均能使4種不同寄主感病，但感病程度在顯癥時間、產孢體形成時間和發病特征上有所差異，這與杜琴等[ 2 ]研究結果：同一菌株對不同寄主的致病力有差異的結論基本一致，但造成致病力差異的原因和機理有待于深入的研究。

3. 3 繼代培養一般會引起微生物退化，但也不排除使微生物增強適應性的可能。蔡國貴等對白僵菌進行繼代培養，發現 11 次繼代培養后不但沒有引起退化，其毒力還有所增強[ 7 - 8 ]。將4種寄主繼1代菌株接種到新疆楊枝條上發現，顯癥時間相同，但新疆楊繼1代菌株在新疆楊枝條上的潛伏期較長，病斑擴展速度較慢，這與孔利等[ 9 ]：不同寄主來源的 C.sacculus菌株對原分離寄主枝條的致病力最強，對其他樹種枝條的致病力較弱的結論有明顯差異。將不同寄主繼代菌株接種新疆楊上發現，新疆楊繼代菌株接種新疆楊上的致病力并不強于其它3種不同寄主菌株接種新疆楊上的致病力，這與陳曉忍等[ 10 ]不同寄主來源的腐爛病菌在自身寄主上的致病力較在其它寄主上強的結論有明顯差異。本研究表明，新疆楊繼代菌株和灰楊繼代菌株隨繼代次數增加致病力增強，銀白楊繼代菌株和胡楊繼代菌株隨繼代次數增加致病力先增強后減弱，這與劉海英[ 11 ]等：隨繼代次數增加，菌絲生長速度變慢、產孢量下降、分生孢子變小、致病性顯著降低、表現出明顯退化現象有明顯差異，其原因可能是由于在不同寄主上連續培養進行互作后引起的。摸清楊樹腐爛病菌對4種楊樹的致病性強弱和楊樹被腐爛病侵染時的抗性還需做進一步的酶活性分子實驗。

參考文獻

[1] 李輝， 余金紅， 高艷榮， 陳慶福. 庫爾勒香梨腐爛病的發生規律及防治措施[J]. 落葉果樹， 2005（2）： 67.

[2] 杜琴. 新疆主要林木腐爛病菌種類鑒定及其防治方法研究[D]. 石河子大學， 2013.

[3] 克熱曼， 蔣衡， 張新平， 等. 克拉瑪依市生態農業開發區主要林木病害名錄[J]. 新疆農業科學， 2006（3）： 192 - 194.

[4] 王峰， 程詩評， 等. 雜交楊轉錄因子Pdt-ERF3抗銹病基因表達[J]. 森林工程， 2016， 32（6）： 10 - 14.

[5] 方中達. 植病研究方法[J]. 北京： 中國農業出版社，1979.

[6] 韋潔玲， 黃麗麗， 郜佐鵬， 等. 蘋果樹腐爛病室內快速評價方法的研究[J]. 植物病理學報， 2010， 40（1）： 14 - 20.

[7] 蔡國貴， 林慶源， 徐耀昌， 等. 白僵菌菌株退化與培養條件關系及其控制技術[J]. 福建林學院學報， 2001（1）：76 - 79.

[8] 劉荻， 何莉莉， 王作喬， 等. 繼代培養對北蟲草菌落形態及子實體產量的影響[J]. 沈陽農業大學學報， 2006（3）： 538 - 541.

[9] 孔利， 吳彩蘭， 郭開發， 等. 林木腐爛病主要致病菌Cytospora sacculus致病力分化的初步研究[J]. 湖北農業科學，2016， 55（3）： 638 - 642.

[10] 陳曉忍. 不同寄主來源腐爛病菌的生物學特性研究及防治梨腐爛病的藥劑篩選[D]. 華中農業大學， 2015.

[11] 劉海英， 白亞君， 張運峰， 等. 繼代培養對玉米大斑病菌生長、 發育和致病性的影響[J]. 玉米科學， 2013， 21（1）： 134 - 136 + 140.

第1作者簡介： 嚴海璘（1996-）， 男， 本科生， 研究方向為植物病理學。

通訊作者： 張王斌（ 1974-）， 男， 副教授， 研究方向為林果樹木腐爛病。

（責任編輯： 王 岳）